蔣奉娟，劉卉萌，陳海嬰，彭國華，周憲民，鄒節(jié)新

(1.南昌大學(xué)1a.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330031；1b.鄱陽湖環(huán)境與資源利用教育部重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌市疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330000)

湖北釘螺(Oncomeania hupensis)系日本血吸蟲的唯一中間宿主，在血吸蟲病的流行過程中具有重要作用,其分布直接決定著血吸蟲病的流行范圍。世界范圍內(nèi)，湖北釘螺主要分布于中國、日本、菲律賓、印尼等國家和地區(qū)[1]。由于地質(zhì)變遷，湖北釘螺被隔離分化為多個亞種或具有明顯地域格局特色的地理群體[2]，其中分布于長江中下游地區(qū)的指名亞種分布廣泛，種群規(guī)模大，孳生環(huán)境多樣、遺傳分化復(fù)雜[3]，且因傳播血吸蟲病對人群威脅最大[4]。由于長江水系洪水頻發(fā)，湖北釘螺指名亞種在空間上呈連續(xù)分布格局，基因交流頻繁，遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜，表現(xiàn)出種群水平的遺傳變異[5]。與此同時，長江中下游地區(qū)釘螺的順?biāo)當(dāng)U散、人為輸入、新螺區(qū)的形成等因素加大了該區(qū)域湖北釘螺指名亞種群體遺傳結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，對當(dāng)?shù)匮x病的防治帶來挑戰(zhàn)。

南昌市疾病預(yù)防控制中心2017年開展贛江流域螺情年度例行性調(diào)查時，于西湖區(qū)朝陽濱江公園贛江江灘約14.8萬平方米范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)較多數(shù)量的釘螺分布。既往的調(diào)查報告表明，湖北釘螺在南昌市僅分布于南昌縣、新建縣、高新區(qū)、安義縣等地[6]，在市區(qū)發(fā)現(xiàn)大范圍的釘螺種群為首次。流行病學(xué)初步調(diào)查結(jié)果顯示，該區(qū)域2015年起因城市化改造移栽來自武漢黃陂區(qū)的景觀蘆葦，此次出現(xiàn)的釘螺種群可能因蘆葦移栽導(dǎo)致人為輸入。為證實該結(jié)果，本研究獲取了南昌市濱江公園、武漢市黃陂區(qū)、上饒市玉山縣、九江市星子縣等地標(biāo)本，采用線粒體12S rRNA、16S rRNA、CO1及其聯(lián)合基因的分子數(shù)據(jù)，結(jié)合GenBank中已公布序列信息，對南昌市濱江公園輸入性湖北釘螺群體進行群體遺傳分析，初步探究其遺傳背景。

1 材料方法

1.1 標(biāo)本采集與數(shù)據(jù)來源

本實驗室已取得來自江西省九江市星子縣、上饒市玉山縣、南昌市濱江公園和湖北省武漢市黃陂區(qū)湖北釘螺標(biāo)本(采集地信息見表1)。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)三地釘螺標(biāo)本均為肋殼釘螺，無明顯差異，不易區(qū)分(圖1)。逸蚴法挑選出無血吸蟲感染成年釘螺個體用于本研究。結(jié)合Genbank中已有序列信息，根據(jù)樣本采樣地地理分布特點，將所有研究種群分為10個組(表2、圖1)。

表1 標(biāo)本采樣地點信息表

表2 數(shù)據(jù)來源信息表

續(xù)表2 數(shù)據(jù)來源信息表

1.2 DNA提取、PCR擴增、基因序列測定

分離酒精固定的釘螺肌肉組織，干燥24 h，使用OMEGA試劑盒(北京百泰克公司)，提取基因組DNA。參照文獻[2,7-8]設(shè)計PCR擴增引物。PCR反應(yīng)體系為30 μL，包括10.5 μL ddH2O，15 μL 2×Es Taq Maste Mix，1.5 μL primer，3 μL模板DNA。各基因PCR擴增條件如下：16S rRNA：94 ℃預(yù)變性3 min、94 ℃變性30 s，12S rRNA：50 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min共30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min；CO1：94 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性40 s、56 ℃退火65 s、72 ℃延伸2 min 30s，共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，選擇條帶清晰明亮、無雜帶、無拖尾且符合目標(biāo)長度的產(chǎn)物進行純化、外送公司測序。

1.3 分子數(shù)據(jù)處理和分析

將測序公司返回的3個基因序列進行人工拼接，DNA Star軟件包Seqman程序進行堿基檢查，Mafft軟件進行比對，Gblock軟件包本地選擇序列的保守區(qū)。(12S rRNA序列由于長度較短，未選擇保守區(qū))利用Sequence Matrix[9-10]軟件聯(lián)合同一個體的CO1、12S rRNA、16S rRNA3個基因序列，PAUP4.0軟件進行同質(zhì)性檢驗，檢測不同基因聯(lián)合分析的可行性[11]；Mega 7軟件基于K-2-P法計算聯(lián)合基因各群組間遺傳距離[12]；DNA sp軟件選擇各基因單倍型[13-14]；Alrequin軟件計算遺傳分化系數(shù)和基因流；Network軟件繪制單倍型網(wǎng)絡(luò)圖[15]。

2 結(jié)果

2.1 序列特征分析

本研究分別獲得湖北釘螺12S rRNA基因76條，16S rRNA基因80條，CO1基因57條，基因序列長度分別為356，503和604 bp。12，16S rRNA和CO1的C+G含量分別32.4%，33.8%，41.6%，A+T含量分別為67.6%，66.2%，58.4%。C+G含量明顯低于A+T含量，符合無脊椎動物線粒體DNA序列的普遍特點[16,17]。將南昌濱江公園未知種群上述3種基因序列分別在GenBank中進行Blast，結(jié)果均顯示其與湖北釘螺指名亞種有較高的同源性。結(jié)合GenBank中已公布的湖北釘螺線粒體基因序列信息，共獲得186條12S rRNA基因序列，136條16S rRNA基因序列和402條CO1基因序列。

2.2 遺傳距離分析

不同基因計算出的長江中下游地區(qū)指名亞種的遺傳距離為0.001～0.022。各基因遺傳距離的結(jié)果存在一定差異：三基因聯(lián)合、線粒體16S rRNA結(jié)果顯示來自濱江公園的C組與來自鄱陽湖地區(qū)的D組間遺傳距離最小，分別為0.005，0.002，而線粒體12S rRNA、CO1基因的結(jié)果顯示來自濱江公園的C組與來組武漢的B組間遺傳距離最小，分別為0.002，0.010(表3～6)

表3 基于線粒體12S rRNA基因構(gòu)建湖北釘螺不同群組間的遺傳距離

表4 基于線粒體16S rRNA基因構(gòu)建湖北釘螺不同群組間的遺傳距離

表5 基于線粒體CO1基因構(gòu)建湖北釘螺不同群組間的遺傳距離

表6 基于三者聯(lián)合基因構(gòu)建湖北釘螺不同群組間的遺傳距離

2.3 遺傳分化分析

基于不同基因的遺傳分化研究結(jié)果均大體呈現(xiàn)亞種間大于亞種內(nèi)的遺傳格局。CO1基因及12S、16S、CO1三者聯(lián)合的基因計算結(jié)果均顯示來自濱江公園的C組與來自武漢的B組間遺傳分化水平最低(Fst分別為0.063 08，0.064 46)，基因流最大,兩群體間處于中度分化水平，基因交流顯著(Nm>4)遺傳背景相似?；?6S rRNA的結(jié)果顯示，雖然來自濱江公園的B組與來自武漢的C組間處于中度分化水平(Fst=0.139 85)，但是其與來自鄱陽湖流域的D組間Fst更小(Fst=0.126 44)，而12S rRNA結(jié)果則顯示C組與來自山區(qū)地區(qū)的E組間Fst更小，基因交流更顯(表7～10)。

表7 湖北釘螺聯(lián)合基因群組間的遺傳分化系數(shù)Fst(左下角)和基因流(右上角)

表8 湖北釘螺12S rRNA基因群組間的遺傳分化系數(shù)Fst(左下角)和基因流(右上角)

表9 湖北釘螺16S rRNA基因群組間的遺傳分化系數(shù)Fst(左下角)和基因流(右上角)

表10 湖北釘螺CO1基因群組間的遺傳分化系數(shù)Fst(左下角)和基因流(右上角)

2.4 單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

單倍型網(wǎng)絡(luò)圖可以直觀展現(xiàn)湖北釘螺個體間單倍型的演化情況，圖中每一種顏色代表一個地理群體，兩個單倍型間的空心節(jié)點表示丟失的單倍型，圓圈的大小代表單倍型的個體數(shù)(圖3～6)。12S rRNA、16S rRNA、COI基因及其三者聯(lián)合基因構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖均表現(xiàn)為長江中下游指名亞種種群聚為一支?；谌蚵?lián)合構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示，來自濱江公園的C組未與任何群體形成共享單倍型，但與來自武漢的B組其單倍型具有直接或較近的演化關(guān)系；在CO1基因構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖中，來自濱江公園的C組與來自武漢的B組間形成一個共享單倍型，且各獨享單倍型間有直接演化關(guān)系，可通過1～3步突變形成。基于12S rRNA和16S rRNA基因構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖均顯示：C組與B、D、E形成一個共享單倍型，C組的獨有單倍型與該共享單倍型間的演化關(guān)系密切。

3 討論

湖北釘螺的輸入性擴散與順?biāo)鲾U散、洪水、人為輸入等因素有關(guān)[18]，其中人為輸入的不可控因素最多、監(jiān)測難度最大，當(dāng)新發(fā)螺區(qū)具備適宜的地質(zhì)條件、氣候條件等生態(tài)因素時，輸入性釘螺更易在此繁殖擴散。本研究基于江西省南昌市濱江公園這一湖北釘螺輸入性擴散事件，運用線粒體基因作為分子標(biāo)記，計算群體遺傳學(xué)相關(guān)參數(shù)，探究了該群體的擴散來源。

3.1 濱江公園湖北釘螺輸入來源來源的群體遺傳學(xué)分析

線粒體基因具有豐富的系統(tǒng)發(fā)育信號，既可以反應(yīng)古老的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系亦可以反應(yīng)近期的改變[19]。在湖北釘螺的研究中，線粒體基因以其特有的優(yōu)越性而廣泛應(yīng)用于湖北釘螺遺傳多樣性、地理群體遺傳學(xué)等領(lǐng)域的研究中[20-21]，其中16S rRNA及CO1基因應(yīng)用最為廣泛，但以12S rRNA基因作為分子標(biāo)記的研究相對匱乏。Saijuntha等人利用線粒體12S rRNA基因探究了湖北釘螺菲律賓亞種的遺傳分化結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明該亞種不同地域間的遺傳分化顯著，其遺傳分化受地理因素影響明顯[22]；MUNEHIRO OKAMOTO等利用12S rRNA分析了釘螺的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，不同亞種在系統(tǒng)發(fā)育樹上呈現(xiàn)獨立的分枝，同時與擬釘螺成為姐妹枝[7]，與以往研究結(jié)果相似，說明該分子標(biāo)記可用于湖北釘螺遺傳分化的研究，但其在GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列信息卻相對匱乏。本研究利用上述3種分子標(biāo)記，探究其對湖北釘螺輸入性種群來源分析中的的應(yīng)用價值。

各基因計算出的種群間的遺傳距離距符合郭平仲提出的同一物種地區(qū)種群內(nèi)的遺傳距離[23]，但同一物種亞種內(nèi)及亞種間遺傳距離的差異尚不顯著。由于該釘螺種群在濱江公園贛江流域洲灘的生存時間較短，其遺傳物質(zhì)尚未產(chǎn)生顯著的差異，因此可用遺傳分化系數(shù)追溯與其親緣關(guān)系較近的群體。聯(lián)合基因與CO1基因所得結(jié)果均顯示，濱江公園群體(C組)與湖北武漢群體(B組)間存在較高程度的基因交流，遺傳背景相似。線粒體12S rRNA和16S rRNA基因的結(jié)果雖有差異，但是濱江公園群體(C組)與其他組間的遺傳分化系數(shù)相差不大，可能由于各組內(nèi)序列數(shù)量較少，部分群組間的遺傳分化系數(shù)不具有統(tǒng)計學(xué)意義，由此導(dǎo)致不同基因分析結(jié)果的差異，仍需補充湖北釘螺指名亞種各群組內(nèi)的序列信息，進一步研究。因為聯(lián)合基因包含更多的遺傳信息，CO1基因各組的序列信息較豐富，其結(jié)果應(yīng)具有更高可靠性。

對于湖北釘螺亞種內(nèi)的不同群體而言，其遺傳分化較低，近期的突變較小，個體間重組頻繁加之廣泛的基因交流，使得二分法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹不能準(zhǔn)確反應(yīng)其實際的基因分化情況，此時，單倍型網(wǎng)絡(luò)圖能夠更準(zhǔn)確的反應(yīng)亞種內(nèi)單倍型間的演化關(guān)系[15]?；诰€粒體12S rRNA和16S rRNA基因構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖均顯示B、C、D、E群體間存在一個共享單倍型，可能為上述4個群體間的祖先單倍型。其原因為：上述4個組群均位于長江中游的干流和支流，存在基因交流，且線粒體12S rRNA和16S rRNA基因進化速度較，且序列短，包含變異位點少，僅反映出歷史事件對線粒體基因的影響，因此濱江公園種群與其他種群間的單倍型演化并非獨立。而CO1基因包含更多變異位點，進化速率更快，對環(huán)境差異的敏感性更高，濱江公園種群在單倍型網(wǎng)絡(luò)圖中與武漢黃陂種群的單倍型間有直接的演化關(guān)系或通過缺失單倍型相連。綜上所述，從分子層面可以證明“南昌市濱江公園輸入性湖北釘螺群體可能由移栽自武漢市黃陂區(qū)的景觀蘆葦攜帶而來”的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果。

3.2 濱江公園湖北釘螺擴散滋生的生態(tài)因素分析

南昌市濱江公園新發(fā)螺區(qū)位于贛江流域東岸洲灘，2015年該區(qū)域曾進行城市化改造，移栽了來自武漢黃陂區(qū)的景觀蘆葦，釘螺種群可吸附于蘆葦輸入至南昌市區(qū)。衛(wèi)星地圖顯示2014年濱江公園贛江洲灘土地裸露無植被覆蓋，到2016年該區(qū)域已經(jīng)被植被覆蓋，適合釘螺滋生繁殖(圖7)。該地處鄱陽湖螺區(qū)與豐城縣歷史血吸蟲病重疫區(qū)之間[24]，具備適宜地質(zhì)條件[25-26]，同時，氣溫等環(huán)境因素也為輸入性釘螺種群的滋生提供了條件。2016年12月至2017年2月江西省平均氣溫9.7 ℃，較同期氣溫偏高2.3 ℃，為1961年來最強的一個暖冬，冬季較高的溫度為釘螺的孳生繁衍提供了極其有利的條件。

4 結(jié)論

本研究，對濱江公園湖北釘螺種群輸入性擴散事件進行了群體遺傳學(xué)分析，驗證了南昌濱江公園新發(fā)現(xiàn)的湖北釘螺種群與武漢黃陂種群間具有較近的親緣關(guān)系，支持疾控部門對其來源于移栽自武漢黃陂區(qū)的蘆葦中的推測，豐富了GenBank中湖北釘螺線粒體12S rRNA基因序列信息，同時表明線粒體CO1基因能夠提供較豐富的信息以追溯湖北釘螺未知群體的來源。本研究結(jié)果提示，需對南昌朝陽濱江公園新發(fā)現(xiàn)的有螺區(qū)域按照我國現(xiàn)行血吸蟲與血吸蟲病的防治管理辦法進行連續(xù)不間斷追蹤與嚴(yán)格監(jiān)控，以防止有螺區(qū)緊急撲滅后可能出現(xiàn)的死角及其殘余釘螺的死灰復(fù)燃。