韓倩 魏江存 陳勇 陸景榮 李金洲 陳子雋

摘要：采用回流提取法提取紅背桂（Excoecaria cochinchinensis Lour.）總黃酮，通過(guò)單因素試驗(yàn)，考察提取方法、提取溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取體積、提取時(shí)間對(duì)其藥材總黃酮提取率的影響，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件，篩選出紅背桂總黃酮的最佳提取工藝。結(jié)果表明，紅背桂總黃酮的最佳提取工藝為70%乙醇、料液比1∶40（g∶mL）、回流提取時(shí)間1.0 h。該方法能有效測(cè)定紅背桂藥材總黃酮含量，重復(fù)性較好、方法穩(wěn)定、可行。

關(guān)鍵詞：紅背桂（Excoecaria cochinchinensis Lour.）;總黃酮;提取工藝

中圖分類(lèi)號(hào)：R282? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）14-0145-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.14.029 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract：The total flavonoids of Excoecaria cochinchinensis Lour. were extracted by reflux extraction method. The effects of extraction method， extraction solvent volume fraction， extraction volume and extraction time on the total flavonoid extraction rate of the medicinal materials were investigated by single factor experiment. The orthogonal test was used to optimize the extraction conditions. The best extraction process for a total flavonoid of Excoecaria cochinchinensis Lour. was screened out. The result showed that the optimal extraction process of a total flavonoid of Excoecaria cochinchinensis Lour. was 70% methanol， the ratio of material to liquid was 1∶40（g∶mL）， and the reflux extraction time was 1.0 h. This method can effectively determine the content of total flavonoids in Excoecaria cochinchinensis Lour. The repeatability was good， the method was stable and feasible.

Key words： Excoecaria cochinchinensis Lour.; total flavonoids; extraction process

中藥紅背桂的藥材基源來(lái)自大戟科海漆屬植物紅背桂花（Excoecaria cochinchinensis Lour.）的全株，該植物首載于《云南藥用植物名錄》[1]，其別名有天青地紅、葉背紅、金鎖玉等。紅背桂花是常綠灌木，株高可達(dá)1～2 m，光滑無(wú)毛，腹面綠色，背面為紫紅色或血紅色[2]，因其花似普通桂花，故有其名[3]。該藥有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、活血止痛的功能，用于治療腮腺炎、扁挑體炎、心絞痛等病癥[4]，越南民間用來(lái)治療尿路痛[5]。紅背桂作為藥用和觀賞植物在廣西、廣東、云南和臺(tái)灣等地均有栽培，廣西龍州有野生種。李子燕等[6]研究了紅背桂花的化學(xué)成分，分離得到6個(gè)黃酮苷類(lèi)化合物，黃酮苷可以起到止痛作用。紅背桂還含有沒(méi)食子酸、熊果酸、山柰酚以及二萜類(lèi)等成分[7-10]。

黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)存在于多種植物中的酚類(lèi)化合物[11]，大部分黃酮類(lèi)化合物的母核均為2-苯基色原酮，具有抗炎、抗菌作用?？傸S酮類(lèi)化學(xué)成分可以抑制血清白細(xì)胞介素（IL-1β）和腫瘤壞死因子（TNF-α）等炎癥因子的分泌[12]。目前，對(duì)中藥紅背桂的總黃酮提取鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究對(duì)紅背桂總黃酮進(jìn)行提取工藝研究，為后續(xù)對(duì)紅背桂總黃酮的藥理活性和作用機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

島津UV1780型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì);十萬(wàn)分之一天平（XS105D，梅特勒-托利多稱(chēng)重設(shè)備系統(tǒng)有限公司）;KQ5200B超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）;SQP電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司];優(yōu)普ULUPURE實(shí)驗(yàn)室超純水儀（上海優(yōu)普實(shí)業(yè)有限公司）;HWS-26電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)藥劑

蘆?。ㄅ?hào)：195128），純度>98%，購(gòu)于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司;其余試劑均為分析純。藥材采摘于廣西賀州市，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)教授陳勇鑒定為大戟科植物紅背桂的全株，經(jīng)55 ℃烘干，備用。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取105 ℃干燥恒重的蘆丁對(duì)照品適量，加70%甲醇溶解，定容至25 mL容量瓶中，搖勻，制成濃度為0.46 mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 精密量取上述對(duì)照品溶液3 mL置于25 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液? ? 1 mL，搖勻，靜置6 min加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，再加4%氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置10 min，以相應(yīng)試劑作空白，采用分光光度法在400～800 nm測(cè)定吸收度，其最大吸收波長(zhǎng)為512 nm（圖1）。

1.3.3 供試品溶液制備 取紅背桂藥材粉末精密稱(chēng)定1.0 g，置于錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇25 mL稱(chēng)定重量，回流提取1.0 h，再稱(chēng)定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，精密量取過(guò)濾液2.0 mL置于50 mL量瓶中，采用分光光度法在波長(zhǎng)512 nm處測(cè)定其吸光度，用回歸方程求出供試品溶液中總黃酮的含量。

1.3.4 線(xiàn)性方程的制定 分別取“1.3.1”的對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL置于25 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉0.4 mL，放置6 min后，加10%硝酸鋁0.4 mL，放置6 min，再加4%的氫氧化鈉4 mL，加水至刻度，搖勻，放置10 min，然后在512 nm處測(cè)定吸光度，并得到線(xiàn)性方程，方程為y= 13.048x-0.040 2，R2=0.999 3，在0.009 2～0.073 6 mg/mL的范圍內(nèi)，樣品濃度與吸光度有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 精密度試驗(yàn) 精密稱(chēng)取紅背桂藥材粉末? ?1.0 g，按“1.3.3”的方法步驟制備供試品，于512 nm波長(zhǎng)處連續(xù)6次測(cè)定其吸光度，結(jié)果RSD為0.58%，小于3.00%，該方法精密度良好。

1.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取紅背桂藥材粉末? ?1.0 g，按“1.3.3”的方法步驟制備供試品，于512 nm波長(zhǎng)處測(cè)定同一供試液在不同時(shí)間下的吸光度，分別在0、10、20、30、40、50、60 min時(shí)測(cè)定，計(jì)算藥材的RSD為2.16%，小于3.00%，結(jié)果表明，供試樣品在60 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取紅背桂藥材粉末樣品6份，每份藥材粉末1.0 g，按“1.3.3”的操作步驟制備供試品。于512 nm波長(zhǎng)處平行測(cè)定其吸光度，計(jì)算紅背桂藥材的平均含量為21.64 mg/g;RSD為2.57%，小于3.00%，表明該方法重復(fù)性良好。

1.4.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批次已知總黃酮含量的紅背桂藥材粉末（含量為21.64 mg/g）0.5 g，共9份，分成3組，即低、中、高加樣組（0.5 g藥材，總黃酮含量分別為80%、100%和120%加樣，精密加入蘆丁對(duì)照品，加樣量分別為8.656、10.820、12.984 mg），按“1.3.3”的方法制備供試品，于512 nm波長(zhǎng)處平行測(cè)定其吸光度，計(jì)算總黃酮含量。由表1可知，紅背桂低、中、高加樣組的總黃酮平均回收率分別為99.67%、99.28%、99.76%，RSD分別為2.84%、1.99%、2.29%（n=3），表明該方法準(zhǔn)確性良好。

1.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

從中藥紅背桂中提取藥材總黃酮的方法主要有有機(jī)溶劑提取法。根據(jù)查閱的相關(guān)文獻(xiàn)[12-16]，采取不同體積分?jǐn)?shù)乙醇為溶劑的提取方法，根據(jù)單因素考察結(jié)果分析，設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、70%、85%）、料液比（1∶30、1∶40、1∶50，g∶mL，下同）、提取時(shí)間（1.0、1.5、2.0 h）3個(gè)條件，選用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取方法 取紅背桂藥材粉末1.0 g，精密稱(chēng)定，置于錐形瓶中，提取時(shí)間60 min，以30 mL、70%乙醇為提取條件，分別采用浸漬法、超聲提取法和回流提取法對(duì)樣品進(jìn)行總黃酮提取，按“1.3.3”的方法制備供試樣品，在512 nm處顯色測(cè)定，結(jié)果（圖2）顯示，采用回流提取法的總黃酮提取率最高，故而選擇回流提取法。

2.1.2 乙醇溶劑體積分?jǐn)?shù) 取紅背桂藥材粉末1.0 g，精密稱(chēng)定，置于錐形瓶中，采用回流提取法，以30 mL不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶劑為提取條件，設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、60%、70%、80%和100%，提取時(shí)間60 min，考察不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶劑對(duì)紅背桂總黃酮提取率的影響，結(jié)果（圖3）顯示，70%乙醇回流提取紅背桂藥材葉片總黃酮，提取率最高。

2.1.3 提取時(shí)間 取紅背桂藥材粉末1.0 g，精密稱(chēng)定，置于錐形瓶中，以30 mL 70%乙醇為提取條件，采用回流提取法，分析不同提取時(shí)間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h對(duì)紅背桂藥材總黃酮提取率的影響，結(jié)果（圖4）顯示，提取時(shí)間為1.5 h時(shí)，總黃酮提取率最高。

2.1.4 提取體積 取紅背桂藥材粉末1.0 g，精密稱(chēng)定，置于錐形瓶中，以提取時(shí)間1.0 h、70%乙醇為提取條件，采用回流提取法分析不同體積70%乙醇對(duì)紅背桂藥材總黃酮提取率的影響，設(shè)置提取體積分別為20、30、40、50、60、70 mL，結(jié)果（圖5）顯示，提取體積為50 mL的提取率最高。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 正交試驗(yàn) 正交試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對(duì)紅背桂總黃酮的提取工藝有較大影響，而提取時(shí)間對(duì)紅背桂總黃酮含量影響較小;方差分析結(jié)果（表4）表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比2個(gè)因素對(duì)紅背桂總黃酮含量具有顯著影響，而提取時(shí)間無(wú)顯著影響，且影響的大小順序?yàn)榱弦罕龋˙）>乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）>提取時(shí)間（C），所以對(duì)紅背桂總黃酮提取效果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素是乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比，而提取時(shí)間沒(méi)有顯著性意義，考慮試驗(yàn)的效率、時(shí)間以及成本，故而選擇提取時(shí)間為1.0 h，紅背桂總黃酮的最適宜提取方案是A2B2C1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)是70%，料液比是1∶40，回流提取時(shí)間是1.0 h，此時(shí)提取效果最佳。

2.2.2 樣品含量測(cè)定 精密稱(chēng)取紅背桂藥材粉末3份，每份1.0 g，置于錐形瓶中，測(cè)定其總黃酮含量，結(jié)果表明，3份藥材總黃酮含量分別為22.15、21.82、22.27 mg/g，平均含量為22.08 mg/g，RSD為1.06%。

3 小結(jié)

以紅背桂藥材為研究對(duì)象，采用回流提取法，考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取體積和提取時(shí)間3個(gè)影響因素對(duì)紅背桂總黃酮提取率的影響，利用正交試驗(yàn)的方法來(lái)優(yōu)選紅背桂總黃酮的最佳提取工藝。確定影響紅背桂總黃酮提取工藝的主要因素是溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取體積和提取時(shí)間，采用L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果表明，紅背桂的最佳提取工藝為回流提取，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶40，提取時(shí)間1.0 h，在此提取條件下效果最佳。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)建立了紅背桂總黃酮提取率的工藝優(yōu)化。方差分析具有顯著性，各因素對(duì)總黃酮提取率影響大小依次為料液比（B）>乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）>提取時(shí)間（C）。

參考文獻(xiàn)：

[1] 云南省藥物研究所. 云南藥用植物名錄[M]. 昆明：云南省藥物研究所，1975.127.

[2] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì). 中國(guó)植物志（ 第44卷第3分冊(cè)）[M]. 北京： 科學(xué)出版社，1997.

[3] 楊延明，蘆翠喬，蔣武生，等. 紅背桂花的組織培養(yǎng)及植株再生[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，1990（8）：25，34.

[4] 中華本草編委會(huì). 中華本草（第12卷）[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999.

[5] GIANG P M，SON P T，MATSUNAMI K，et al. New megastigmane glucosides from Excoecaria cochinchinensis LOUR. var. cochinchinensis[J]. Chemical & pharmaceutical bulletin，2005，53（12）：1600-1603.

[6] 李子燕，楊靖華，汪云松，等. 紅背桂花化學(xué)成分研究[J]. 中草藥，2006（6）：826-829.

[7] 陳兵祥，王小玲. 紅背桂花的化學(xué)成分研究[J]. 藥學(xué)研究，2015，34（3）：147-149.

[8] 王業(yè)玲，黎 平，郭凱靜，等. 紅背桂花化學(xué)成分研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2014，26（1）：47-49.

[9] 汪云松，黃 榮，張洪彬，等. 紅背桂花化學(xué)成份研究[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2009，17（2）：156-159.

[10] 王 碩，周小雷，袁經(jīng)權(quán)，等. 紅背桂藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]. 中國(guó)藥房，2013，24（27）：2542-2545.

[11] 李萌茹，周玉枝，杜冠華，等. 中藥黃酮類(lèi)化合物抗衰老作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J/OL]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，http：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.2163.R.20190628.1634.017.html，2019.

[12] 曹劍鋒，劉其高，蔣小飛，等. 陰地蕨總黃酮的提取及抗氧化活性研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（21）：228-231.

[13] 魏江存，陳 勇，謝 臻，等. 10批不同產(chǎn)地六棱菊中咖啡酸的工藝優(yōu)化與含量測(cè)定[J]. 中國(guó)藥房，2017，28（34）：4792-4795.

[14] 李思陽(yáng)，孔慶新，莊潤(rùn)澤，等. 香椿子中總黃酮提取工藝的優(yōu)化和比較[J]. 中成藥，2017，39（10）：2178-2182.

[15] 魏江存，陳 勇，謝 臻，等. 六棱菊薄層鑒別和綠原酸的提取工藝及其含量測(cè)定[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2017，28（11）：2611-2614.

[16] 陳 勇，李金洲，魏江存，等. 壯藥一匹綢薄層鑒別和咖啡酸提取工藝及含量測(cè)定[J]. 吉林中醫(yī)藥，2019，39（1）：92-97.