仵永楓 張玉 林畫(huà)偉

[摘要] 目的 探討抑制半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（caspase）-1對(duì)大鼠急性肝衰竭（ALF）的保護(hù)作用。 方法 將60只健康雄性Wistar大鼠體重150～180 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為對(duì)照組、模型組和干預(yù)組，每組20只。對(duì)照組取血清和肝組織;模型組采用大鼠腹腔聯(lián)合注射1200 mg/kg D-氨基半乳糖（D-GalN）及100 μg/kg脂多糖（LPS）建立ALF模型，并且分別于造模24 h后取血清及肝組織;干預(yù)組造模前2 h予大鼠尾靜脈注射6 mg/kg caspase-1特異性抑制劑氟甲基酮，造模時(shí)同模型組劑量予D-GalN及LPS，造模24 h后取肝組織及血清。肝臟組織進(jìn)行HE染色觀察，并對(duì)血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBil）和白細(xì)胞介素（IL）-1β進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果 HE染色結(jié)果提示模型成功。模型組ALT、AST、TBil和IL-1β水平均高于對(duì)照組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01），干預(yù)組大鼠ALT、AST、TBil及IL-1β水平均低于模型組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。 結(jié)論 caspase-1所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)是ALF損傷的重要原因之一，有望成為ALF的預(yù)測(cè)因子和未來(lái)的治療靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 急性肝衰竭;炎癥小體;氟甲基酮;半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1

[中圖分類號(hào)] R575.3? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）08（a）-0008-04

[Abstract] Objective To investigate the protective effect of inhibiting cysteinyl aspartate-specific proteinase （caspase）-1 on acute liver failure （ALF） in rats. Methods A total of 60 healthy male Wistar rats， weighing about 150-180 g， were divided into the control group， the model group and the intervention group by random number table method， with 20 rats in each group. In the control group， serum and liver tissue were collected. In the model group， rats were intraperitoneally injected with 1200 mg/kg D-galactosamine （D-Galn） and 100 g/kg liponolysaccharide （LPS） to construct the ALF model. Serum and liver tissue were collected 24 h after modeling. In the intervention group， rats were injected with 6 mg/kg of thespecific inhibitor of caspase-1， fluoromethylketone by tail vein in the two hours before modeling. The D-GalN and LPS were given to the same dose as the model group during modeling. Serum and liver tissue were collected in the 24 hours after modeling. The liver tissues were observed by HE staining， and serum levels of alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， total bilirubin （TBil） and interleukin （IL） -1β were measured. Results HE staining results indicated that the model was successful. ALT， AST， TBil and IL-1β levels in the model group were higher than those in the control group， the differences were all highly statistically significant （all P < 0.01）， and ALT， AST， TBil and IL-1β levels in the intervention group were lower than those in the model group， the differences were all highly statistically significant （all P < 0.01）. Conclusion The inflammatory response caused by caspase-1 is one of the important causes of ALF injury and is expected to be a predictor of ALF and a future therapeutic target.

[Key words] Acute liver failure; Inflammasome; Fluoromethylketone; Caspase-1

急性肝功能衰竭（acute liver failure，ALF）是指由病毒或藥物引起的嚴(yán)重肝功能損害。具有起病急，肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重，死亡率高的特點(diǎn)[1-2]。

炎癥小體是一種由生理和致病性刺激反應(yīng)而形成的多聚體。炎癥小體根據(jù)結(jié)構(gòu)特征可劃分為核苷酸結(jié)合區(qū)樣受體（nucleotide-binding domain-like receptors，NLRs）（又稱作NALP）、黑色素瘤2樣受體（melanoma 2-like receptors，ALRs）等。這些受體具有活化半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（cysteinyl aspartate-specific proteinase，caspase）-1家族的能力[3-4]。炎癥小體可通過(guò)影響caspase-1的活化，對(duì)ALF的進(jìn)展發(fā)揮重要的作用。Kim等[5]發(fā)現(xiàn)在小鼠ALF模型中，NLRP3基因表達(dá)升高，繼而caspase-1、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）基因表達(dá)隨之明顯升高。本研究通過(guò)建立大鼠ALF模型，并通過(guò)給予caspase-1特異性抑制劑，觀察抑制caspase-1對(duì)ALF是否有保護(hù)作用，期待為防治ALF提供新思路。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只健康Wistar雄性大鼠，清潔級(jí)，5周，體重150～180 g。確保無(wú)病，體重相近，皮毛光澤，有精神，反應(yīng)靈活，購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)醫(yī)學(xué)軍事科學(xué)院動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（軍）2009-003。本研究方案在首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批后實(shí)施。于室溫20～25℃飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)鼠食，自由飲水，1周后用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。

1.2 主要儀器與試劑

D-氨基半乳糖（D-GalN）（批號(hào)：G0500）、脂多糖（LPS）（批號(hào)：L2880）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;大鼠血清IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（批號(hào)：ab100768）購(gòu)自美國(guó)abcam公司，Model 550酶標(biāo)儀（BioRad公司，美國(guó)），光學(xué)顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分成3組：對(duì)照組（n = 20），取血清和肝組織;模型組（n = 20），予大鼠腹腔聯(lián)合注射1200 mg/kg D-GalN及100 μg/kg LPS建立ALF模型，并且于造模24 h后取血清及肝組織;干預(yù)組（n = 20）：予大鼠尾靜脈注射6 mg/kg caspase-1特異性抑制劑氟甲基酮（Z-YVAD-fmk），2 h后予模型組相同劑量的D-GalN及LPS，24 h后取肝組織及血清。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1 病理學(xué)檢查? 取大鼠肝組織，10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，光鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。造模成功判斷標(biāo)準(zhǔn)參考肝衰竭診治指南2018版[6]：肝組織內(nèi)細(xì)胞大塊壞死（壞死范圍超過(guò)肝實(shí)質(zhì)的2/3），亞大塊壞死（占肝實(shí)質(zhì)的1/2～2/3）或橋接壞死（較廣泛的融合性壞死并破壞肝實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)），伴存活肝細(xì)胞嚴(yán)重變性，肝竇網(wǎng)狀支架塌陷或部分塌陷。

1.4.2 血生化指標(biāo)? 血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和總膽紅素（total bilirubin，TBil）的測(cè)定由首都醫(yī)科大學(xué)佑安醫(yī)院門(mén)診臨床檢驗(yàn)中心實(shí)施。

1.4.3 ELISA法檢測(cè)大鼠血清的IL-1β的含量? 從-80℃冰箱內(nèi)取出各組大鼠血清，采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定大鼠血清的IL-1β的含量，操作過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組樣本均數(shù)比較采用One-way ANOVA 分析，組間兩兩比較方差齊者用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊者用Games-Howell法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝功能的變化

三組ALT、AST、TBil整體比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），模型組ALT、AST、TBil較對(duì)照組明顯升高，干預(yù)組ALT、AST、TBil較模型組明顯降低，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠肝組織病理變化

對(duì)照組大鼠肝組織小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列（圖1A）。模型組肝組織中肝細(xì)胞壞死嚴(yán)重，鏡下可見(jiàn)2/3以上面積的肝細(xì)胞壞死，并形成大片、亞大片及橋接壞死（圖1B）。而干預(yù)組大鼠肝組織中肝細(xì)胞無(wú)明顯的細(xì)胞壞死，僅細(xì)胞輕度腫脹伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝組織病理?yè)p傷減輕（圖1C）。

2.3 各組大鼠血清IL-1β濃度的變化

三組IL-1β濃度整體比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），模型組IL-1β濃度較對(duì)照組明顯升高，干預(yù)組IL-1β較模型組明顯降低，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。見(jiàn)表2。

3 討論

ALF是臨床危重疾病之一，治療效果不理想，預(yù)后較差。炎癥小體是一組蛋白復(fù)合物的統(tǒng)稱，目前發(fā)現(xiàn)的炎癥小體有NLRP1、NLRP3、NLRC4和AIM2等。它們可以激活caspase-1前體成為有活性的caspase-1，進(jìn)而促進(jìn)IL-1β及IL-18等前炎癥因子的生物學(xué)成熟，參與固有免疫反應(yīng)[7-8]。

目前研究發(fā)現(xiàn)炎癥小體的活化與多種肝臟疾病相關(guān)。有研究認(rèn)為，NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的激活在非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)生發(fā)展起重要作用[9-11]。在肝臟缺血再灌注損傷的過(guò)程中，NLRP3炎癥小體的活化加重肝臟的損傷[12]。在D-GalN/LPS誘導(dǎo)的大鼠ALF中caspase-1和IL-18表達(dá)升高[13]。LPS和脂肪酸可導(dǎo)致IL-1β的產(chǎn)生和NLRP3的強(qiáng)烈激活[14-15]。此外，誘導(dǎo)caspase-1蛋白水解有保肝的效果[16]。炎癥小體在肝纖維化的進(jìn)展過(guò)程中起著重要作用[17]。

caspase-1特異性抑制劑在大鼠急性大腦中動(dòng)脈阻塞模型以及大鼠急性胰腺炎模型中，均可起到保護(hù)作用[18-19]。另外，在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的鼠模型中，敲除caspase-1基因，可延緩細(xì)胞凋亡及炎癥細(xì)胞的聚集[20]。

本研究采用Z-YVAD-fmk予造模前2 h對(duì)大鼠進(jìn)行尾靜脈注射，并予D-GalN/LPS造模24 h后比較觀察大鼠肝功能的變化水平，發(fā)現(xiàn)干預(yù)組肝功能指標(biāo)水平較模型組顯著降低。與此同時(shí)，病理變化方面，Z-YVAD-fmk干預(yù)后干預(yù)組大鼠肝臟病理改變與模型組比較，其肝組織損傷較輕，未出現(xiàn)彌漫性的大片、亞大片及橋接壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)存在，小葉和匯管區(qū)內(nèi)的炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。此外，予大鼠腹腔聯(lián)合注射D-GalN/LPS后，大鼠血清IL-1β濃度升高，予Z-YVAD- fmk干預(yù)后，檢測(cè)大鼠血清IL-1β濃度，干預(yù)組明顯低于模型組大鼠血清IL-1β濃度，可證實(shí)在本實(shí)驗(yàn)中，Z-YVAD-fmk有效抑制了caspase-1的活性。由此可見(jiàn)，抑制caspase-1的活性，可明顯改善肝功能、減輕肝臟損傷。故推測(cè)炎癥小體通路可能參與ALF的病理生理過(guò)程，而阻斷該途徑可對(duì)ALF發(fā)揮重要的保護(hù)作用。

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（收稿日期：2020-03-12）