高碩，周萬青，朱宏，周輝，張燕，張之烽，曹小利，沈瀚

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗科，南京 210008)

利奈唑胺作為噁唑烷酮類抗菌藥物，廣泛應(yīng)用于革蘭陽性球菌引起的嚴(yán)重感染，是治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)的一個重要選擇[1]。然而，在全球范圍內(nèi)，利奈唑胺耐藥金黃色葡萄球菌感染病例相繼出現(xiàn)，給臨床治療帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[2]。目前已知的利奈唑胺耐藥主要機制是23S rRNA基因V區(qū)核苷酸突變、核糖體L3和(或)L4突變以及菌株攜帶氯霉素-氟甲砜霉素耐藥基因(chloramphenicol-florfenicol resistance，cfr)[3]。近年發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)糞腸球菌利奈唑胺耐藥的決定基因optrA[4]在凝固酶陰性葡萄球菌中也有檢出[5]，以及由新型poxtA基因介導(dǎo)的利奈唑胺耐藥MRSA被檢出[6]，進(jìn)一步揭示革蘭陽性菌對利奈唑胺耐藥機制的多元化。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，獲得cfr基因或 23S rRNA G2576T突變是導(dǎo)致凝固酶陰性葡萄球菌對利奈唑胺耐藥的主要機制[7]，并存在江蘇地區(qū)內(nèi)的克隆傳播。

美國LEADER項目2011—2015年數(shù)據(jù)顯示，金黃色葡萄球菌利奈唑胺不敏感率為0.1%[8]。2018年CHINET中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測結(jié)果顯示，甲氧西林耐藥凝固酶陰性葡萄球菌(methicillin resistant coagulase-negativeStaphylococcus，MRCNS)和甲氧西林敏感凝固酶陰性葡萄球菌(meticillin-sensitive coagulase-negativeStaphylococcus，MSCNS)對利奈唑胺的耐藥率分別為0.5%和0.1%，未檢出利奈唑胺耐藥的MRSA[9]。而本課題組在對我院臨床分離金黃色葡萄球菌藥敏監(jiān)測中檢出1株利奈唑胺耐藥MRSA菌株，并利用全基因組測序技術(shù)分析其對利奈唑胺的耐藥機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1菌株 收集南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院2019年1月至12月臨床分離非重復(fù)金黃色葡萄球菌905株，主要分離自痰液(52%)、分泌物(29%)、血液樣本(7%)及其他類型標(biāo)本(12%)。所有菌株均經(jīng)Vitek 2 Compact GP板卡鑒定并經(jīng)Vitek質(zhì)譜儀復(fù)核。金黃色葡萄球菌ATCC 29213、cfr基因陽性對照頭狀葡萄球菌SA10106為本實驗室保存[10]。

1.2主要試劑與儀器 Vitek 2 Compact 全自動鑒定儀及配套 GP 鑒定卡、GP67 藥敏卡、Vitek MS(法國生物梅里埃公司),利奈唑胺 E-test試紙條(鄭州安圖生物公司),DNA提取試劑盒及膠回收試劑盒(北京天根公司),2×Taq Mix(DBI公司),LB肉湯(科瑪嘉公司),PCR引物由上海生工公司合成；2720 Thermal Cycler PCR儀、ABI 3730XL基因測序儀(美國ABI公司)；Gel-Doc XR型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司)。

1.3藥敏試驗 用Vitek 2 Compact 配套 GP67 藥敏卡檢測菌株對常規(guī)藥物的敏感性。用E-test法復(fù)測利奈唑胺耐藥菌株對利奈唑胺的最低抑菌濃度(MIC)，判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)2019年標(biāo)準(zhǔn)[11]。

1.4DNA提取 挑取純培養(yǎng)菌落接種至LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)16 h，用DNA提取試劑盒提取菌液基因組DNA，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。所提核酸用于全基因組測序及基因擴(kuò)增。

1.5PCR擴(kuò)增和序列分析 參照文獻(xiàn)[7]合成23S rRNA第V功能區(qū)基因、cfr基因以及optrA基因，引物序列見表1。反應(yīng)體系為50 μL：2×Taq Mix 25 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，ddH2O 19 μL。 PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，陽性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后切膠回收，用柱層析法純化后用ABI 3730XL基因測序儀進(jìn)行Sanger雙向測序(由上海生工公司完成)，正、反向測序片段采用DNAMAN8軟件拼接，結(jié)果經(jīng)BLAST與GenBank進(jìn)行比對。

表1 靶基因PCR引物序列及產(chǎn)物大小

1.6全基因組測序分析 委托上海澤塔生物科技公司用Illumina HiSeq 2000測序系統(tǒng)進(jìn)行全基因組DNA測序。簡要步驟：對樣本DNA進(jìn)行雙向(paired-end，PE)測序，構(gòu)建450 bp文庫；對測序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量剪切后，用MicrobeTrakr plus v. 0.9.1軟件對序列進(jìn)行拼接，得到最優(yōu)的組裝結(jié)果。用GeneMarkS+v.4.11基因注釋軟件對測序結(jié)果進(jìn)行預(yù)測。將預(yù)測得到的基因序列分別與KEGG、COG、GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，獲得預(yù)測基因的注釋信息。利用Center for Genomic Epidemiology 網(wǎng)站(http://www.genomicepidemiology.org)中的LRE-Finder 1.0、ResFinder 3.2、VirulenceFinder 及 PlasmidFinder 軟件對耐藥基因、毒力基因、利奈唑胺耐藥相關(guān)突變及質(zhì)粒分型進(jìn)行預(yù)測分析。

1.7多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST) 用PCR方法進(jìn)行菌株MLST分析[12]。參照金黃色葡萄球菌MLST數(shù)據(jù)庫(https://pubmlst.org/saureus/)中引物序列，合成金黃色葡萄球菌7個管家基因arc、aro、glp、gmk、pta、tpi和yqi擴(kuò)增引物，并依據(jù)網(wǎng)站條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序。PCR反應(yīng)體系及序列分析同1.5。通過將測序序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得菌株MLST型別。pta等位基因型未在數(shù)據(jù)庫中獲得匹配，將序列及測序文件遞交至Sequence/profile definitions數(shù)據(jù)庫(https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_saureus_seqdef)以獲得新的等位基因編號及ST型別。

2 結(jié)果

2.1利奈唑胺耐藥菌株篩選 905株金黃色葡萄球菌對青霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、復(fù)方磺胺甲噁唑和左氧氟沙星的耐藥率分別為97.2%、38%、59.7%、29.3%、34.7%、5.9%和38.1%，未檢出萬古霉素不敏感菌株，MRSA檢出率為49.8%，檢出1株(0.1%)利奈唑胺耐藥菌株(實驗室編號SA12095)。該菌株對萬古霉素和復(fù)方磺胺甲噁唑敏感，對青霉素、苯唑西林、環(huán)丙沙星、紅霉素、克林霉素、四環(huán)素及左氧氟沙星均耐藥；E-test檢測利奈唑胺MIC值為16 mg/L。

2.2耐藥基因檢測結(jié)果 PCR結(jié)果顯示SA12095攜帶cfr基因，未檢出optrA基因。見圖1。經(jīng)測序，23S rRNA V 區(qū)發(fā)生T2337G和C2370G 2個核苷酸位點的突變。

注：M，2000 bp DNA ladder maker；1，cfr基因陽性對照(SA10106)；2，cfr基因(SA12095菌株)；3，optrA基因(SA12095菌株)；4，23S rRNA V區(qū)(SA12095菌株)；5，23S RNA V區(qū)(ATCC 29213菌株)。

2.3基因組概述 SA12095基因組大小為2 949 411 bp，GC含量為48.5%，總基因數(shù)為3 023個，基因組含有2 876個編碼序列、59個tRNA編碼基因以及7個完整的rRNA基因編碼的操縱子。耐藥基因預(yù)測分析顯示，該菌株攜帶cfr、norA、aadD、spc、aac(6′)-aph(2′′)、erm(A)、tet(K)、blaZ、mecA及l(fā)nu(A)。毒力基因主要有sak、scn、hlgA、hlgB、hlgC、lukD、lukE、sea、sec、sel、sem、aur、splA及splB。質(zhì)粒分型預(yù)測主要為攜帶Increp7a、Increp5a、Increp19及Increp16的質(zhì)粒。全基因序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，GeneBank號為JAANYO000000000。

2.4MLST結(jié)果 經(jīng)PCR擴(kuò)增及測序，SA12095菌株管家基因pta序列與數(shù)據(jù)庫中pta249相比存在1個堿基突變(A39536T)。將序列上傳至金黃色葡萄球菌MLST Sequence/profile definitions數(shù)據(jù)庫，獲得新的等位基因型為pta731，獲得7個位點(arc/aro/glp/gmk/pta/tpi/yqi)的等位基因編碼依次為1、4、1、4、731、1、10，上傳至上述數(shù)據(jù)庫獲得SA12095菌株ST型為新型ST5985。

3 討論

本文對我院2019年度臨床分離金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥敏監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)1株(0.1%)利奈唑胺耐藥菌株，分離率與文獻(xiàn)報道相近[8]。雖然目前本院臨床分離金黃色葡萄球菌對利奈唑胺耐藥率較低，但仍需加強監(jiān)控，早期發(fā)現(xiàn)并實施可能的院內(nèi)播散流行的阻斷措施。目前報道的利奈唑胺耐藥MRSA ST分型主要有ST36[13]及ST5[14-15]等，本文分離SA12095菌株pta等位基因為新的基因型，并被 MLST 數(shù)據(jù)庫確認(rèn)為新型ST5985。

利奈唑胺主要通過與細(xì)菌50S核糖體亞基的肽基轉(zhuǎn)移酶中心(peptidyl transferase center，PTC)結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的合成從而發(fā)揮抗菌作用。細(xì)菌對利奈唑胺耐藥的主要機制之一是細(xì)菌23S rRNA V區(qū)點突變，導(dǎo)致藥物與靶位親和力減低，其中以G2576T點突變發(fā)生率最高[2,7]。姚偉明等[16]對利奈唑胺誘導(dǎo)耐藥的MRSA菌株進(jìn)行全基因組測序發(fā)現(xiàn)，23S rRNA V區(qū)發(fā)生G2447T突變。Wu等[17]對臨床患者血液中檢出的利奈唑胺耐藥MRSA進(jìn)行全基因組測序分析，發(fā)現(xiàn)存在23S rRNA V區(qū)G2576T和G2234A位點突變。但除G2576T外，對于其他突變位點與利奈唑胺耐藥的相關(guān)研究數(shù)據(jù)仍缺乏。不同于此前的報道，我們通過PCR聯(lián)合Sanger測序技術(shù)以及全基因組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)SA12095菌株存在23S rRNA V區(qū) T2337G和C2370G 2個新的核苷酸突變位點。由于該菌株同時檢出cfr基因而未檢出optrA基因，我們推測，SA12095菌株對利奈唑胺耐藥與菌株攜帶cfr基因有關(guān)。近年來由cfr介導(dǎo)的利奈唑胺耐藥菌株在一些國家引起暴發(fā)流行[18]。有報道顯示cfr基因位于pLRSA417質(zhì)粒上，因此需警惕耐藥性在不同種屬細(xì)菌之間的傳播[15]。本院此前檢出cfr基因介導(dǎo)利奈唑胺耐藥的頭狀葡萄球菌的流行[10]。最近發(fā)現(xiàn)江蘇地區(qū)流行的耐利奈唑胺凝固酶陰性葡萄球菌主要由cfr基因和23S rRNA Ⅴ區(qū) G2576T突變造成，并存在頭狀葡萄球菌和人葡萄球菌的跨地區(qū)克隆播散[7]。因此，對于SA12095菌株中cfr基因的來源和定位研究將為可能的耐藥基因傳播及防控奠定理論基礎(chǔ)。另外，全基因組測序分析提示SA12095菌株同時攜帶tet(K)、blaZ、mecA等基因，并與菌株對四環(huán)素、青霉素及苯唑西林耐藥表型相一致。由此可見，全基因組測序分析可為耐藥基因研究提供支持性數(shù)據(jù)。研究表明，利奈唑胺暴露可能是利奈唑胺耐藥菌株感染的危險因素[13]，亦有耐藥菌株在未使用過利奈唑胺患者的樣本中檢出的報道[14]。本文菌株分離自多發(fā)性骨髓瘤合并肺部感染患者痰液樣本，該患者在SA12095檢出前15 d有連續(xù)7 d的利奈唑胺使用史。因此，我們推測SA12095耐藥性的產(chǎn)生可能與利奈唑胺暴露有關(guān)。

本文對耐藥監(jiān)測中所檢出的1株利奈唑胺耐藥MRSA進(jìn)行全基因組測序并結(jié)合PCR及測序技術(shù)，揭示該菌株是由cfr基因介導(dǎo)的利奈唑胺耐藥，并且為新型ST型MRSA(ST5985)，提示目前流行的利奈唑胺耐藥MRSA仍為地區(qū)性散發(fā)。但攜帶可經(jīng)質(zhì)粒介導(dǎo)傳播的cfr基因是可能造成其水平傳播的危險因素，因此，建議臨床密切監(jiān)測耐藥菌株的出現(xiàn)，并與醫(yī)院感染控制部門合作，及時阻斷進(jìn)一步播散。