張雪，謝小芳，王敏，鄭毅，杜鴻

(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科，江蘇蘇州 215004)

碳青霉烯類藥物是治療腸桿菌科細菌感染，特別是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰氨酶(ESBLs)和/或AmpC酶的多重耐藥腸桿菌科細菌的一線藥物之一[1]。據(jù)中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(China Antimicrobial Surveillance Network，CHINET,http://www.chinets.com.)數(shù)據(jù)顯示，腸桿菌科細菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率一直呈上升趨勢，分別從2005年的3.1%和2.1%上升至2019年的11.5%和11.4%。而多黏菌素用于治療多重耐藥革蘭陰性桿菌感染的應(yīng)用也越來越多。然而碳青霉烯類和多黏菌素耐藥性的共同出現(xiàn)，成為臨床治療難題，使感染控制和管理變得更加困難。

目前，多黏菌素、替加環(huán)素以及頭孢他啶/阿維巴坦是碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CRE)造成感染的有效治療藥物。在我國，多黏菌素于2017年1月被批準作為注射藥物用于治療細菌感染，并于2017年底被臨床采用(http://www.mohrss.gov.cn/gkml/zcfg/gfxwj/201702/t20170223_266775.html)。但多黏菌素作為老藥新用，仍存在很多問題。本研究收集3個不同地區(qū)2017年1月至12月臨床CRE分離株，檢測多黏菌素耐藥CRE流行狀況和耐藥機制，為采取合理的用藥方案，遏制此類菌株的持續(xù)感染和暴發(fā)流行提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2017年1月至12月蘇州、成都、北京3個地區(qū)臨床連續(xù)分離的非重復(fù)CRE共341株，包括肺炎克雷伯菌218株、大腸埃希菌62株、陰溝腸桿菌31株、弗氏檸檬酸桿菌11株、產(chǎn)氣克雷伯菌10株、產(chǎn)酸克雷伯菌5株和黏質(zhì)沙雷菌4株。根據(jù)美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)2018年更新的指南，亞胺培南、美羅培南和厄他培南最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)>2 μg/mL即為耐藥[2]，至少對其中之一耐藥的腸桿菌科細菌判定為CRE。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922為本實驗室保存菌種。所有菌株經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)儀鑒定到種。

1.2儀器和試劑 MALDI-TOF MS儀(德國Bruker公司)，Phoenix-100全自動細菌鑒定儀、Phoenix M50自動微生物系統(tǒng)(美國BD公司)，PCR擴增儀(美國Applied Biosystems公司)，凝膠成像系統(tǒng)分析儀、實時熒光定量PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司)，核酸檢測儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，3730xl測序儀(美國ABI公司)；多黏菌素B(美國Sigma公司)，DL2000分子質(zhì)量標準marker(日本TaKaRa公司)，Trizol試劑(Ambion公司)，第一鏈cDNA合成試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)，SYBR Green PCR Master Mix(美國Applied Biosystems公司)，PCR引物由上海Sangon公司合成。

1.3藥敏試驗 用歐洲藥敏試驗委員會(European Commitee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)推薦的微量肉湯稀釋法檢測并判讀多黏菌素B的MIC值[3]。對多黏菌素耐藥CRE菌株，其他常用臨床抗菌藥物的體外藥敏試驗由Phoenix M50自動微生物系統(tǒng)進行評估，并按照2018年CLSI標準，用K-B法復(fù)核，并用CLSI指南或EUCAST指南(替加環(huán)素)進行解釋[2-3]。

1.4多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST) 使用文獻報道的引物序列、反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)，用PCR法擴增多黏菌素耐藥的肺炎克雷伯菌(rpoB、infB、phoE、mhd、pgi、gapA、tonB)[4]、大腸埃希菌(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、recA)[5]和陰溝腸桿菌(rpoB、dnaA、fusA、gyrB、pyrG、rplB、leuS)[6]各自7個管家基因。PCR擴增產(chǎn)物由上海Sangon公司用3730xl測序儀進行Sanger法測序，用Chromas軟件分析，測序結(jié)果與http//www. mlst.net上公布的相應(yīng)基因的等位基因序列進行比較，獲得該菌株針對7個管家基因的等位基因譜，提交MLST網(wǎng)站，確定臨床分離株的序列分型(sequence type，ST)。

1.5多黏菌素耐藥基因mcr-1～mcr-9檢測 用PCR技術(shù)檢測多黏菌素耐藥CRE菌株中質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥基因mcr-1～mcr-9。mcr-1～mcr-8引物序列參考Rebelo等[7]和Borowiak等[8]研究。mcr-9引物根據(jù)GenBank中發(fā)表的基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，MCR-9F：5′-TTTGATTGCAGGTGTTGCCG-3′，MCR-9R：5′-ACAACCGCCATCGTTCTCTT-3′。反應(yīng)體系共20 μL，包括5.0 μmol/L上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，PCR mixture 10 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴增陽性產(chǎn)物由上海Sangon公司用3730xl測序儀進行Sanger法測序，用Chromas軟件分析，測序結(jié)果與GenBank的原序列進行比對。

1.6多黏菌素耐藥調(diào)控基因突變檢測 用PCR技術(shù)對多黏菌素耐藥CRE菌株的耐藥調(diào)控基因pmrA、pmrB、phoP、phoQ、mgrB[9]進行擴增，使用文獻報道的引物序列、反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)。PCR擴增產(chǎn)物由上海Sangon公司用3730xl測序儀進行Sanger法測序，用Chromas軟件分析，測序結(jié)果與GenBank的原序列進行比對，分析突變位點。

1.7實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR) 對多黏菌素耐藥CRE菌株，以同期臨床分離的多黏菌素敏感CRE菌株為對照，采用RT-qPCR檢測多黏菌素耐藥調(diào)控基因pmrA、pmrC、pmrK和phoQ表達量的變化。根據(jù)GenBank中發(fā)表的基因序列，通過Primer Premier 5.0設(shè)計特異性引物，引物序列見表1。

將菌株在陽離子調(diào)節(jié)Mueller-Hinton肉湯(CAMHB)中培養(yǎng)至生長對數(shù)期，即0.5麥氏濁度單位，采用Trizol法提取細菌總RNA。按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系共20 μL，包括5×Reaction Buffer 4 μL，RiboLockTMRNA酶抑制劑(20 U/μL)1 μL，10 mmol/L dNTP mixture 2 μL，RevertAidTMM-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)1 μL，RNA模板1 μL，DEPC水11 μL。反轉(zhuǎn)錄條件為：25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。

采用相對定量的方法，以ropB為內(nèi)參，按照SYBR Green PCR Master Mix操作步驟進行RT-qPCR。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)孔，以DEPC水為空白對照模板。反應(yīng)體系共20 μL，包括1∶10稀釋的cDNA模板1 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，54 ℃退火/延伸，共40個循環(huán)；72 ℃開始檢測，以0.5 ℃為臺階溫度停留5 s采集熒光信號，進行熔解曲線分析。計算相對表達量，目的基因相對表達量= 2-ΔΔCt，其中Ct為閾值循環(huán)數(shù)，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt= ΔCt實驗組-ΔCt對照組。

表1 引物序列

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 用GraphPad Prism 7.0軟件進行。采用非配對t檢驗和Welch′s correction，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1藥敏試驗結(jié)果 多黏菌素藥敏檢測結(jié)果顯示，11株(3.2%，11/341)CRE對多黏菌素耐藥。肺炎克雷伯菌耐藥率最高(3.7%，8/218)，其次是大腸埃希菌(3.2%，2/62)和陰溝腸桿菌(3.1%，1/32)。

臨床常用抗菌藥物藥敏檢測結(jié)果顯示，多黏菌素耐藥菌株對碳青霉烯類藥物、頭孢菌素、氨曲南、β-內(nèi)酰胺類/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合物、喹諾酮類耐藥率均較高(>70%)，對阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑的耐藥率較低，分別為9.1%、36.4%、27.3%、45.4%。見表2。

表2 多黏菌素耐藥CRE菌株抗菌藥物藥敏結(jié)果[n(%)]

2.2MLST分型 MLST分型顯示，11株多黏菌素耐藥CRE菌株中，肺炎克雷伯菌中以ST48型為主(75.0%，6/8)，其次是ST11型(25.0%，2/8)。2株大腸埃希菌分別為ST131型和ST156型，1株陰溝腸桿菌為ST74型。

2.3多黏菌素耐藥基因mcr-1～mcr-9檢測結(jié)果 11株多黏菌素耐藥CRE中，檢出2株大腸埃希菌攜帶mcr-1基因，1株陰溝腸桿菌攜帶mcr-9基因，經(jīng)測序分析，與GenBank的原序列(MT070410.1和MK070339.1)一致性為100%。8株肺炎克雷伯菌均未檢出mcr-1～mcr-9。部分電泳結(jié)果見圖1。

2.4多黏菌素耐藥調(diào)控基因檢測結(jié)果 在1株肺炎克雷伯菌中檢出mgrB基因第41個堿基處插入1個反向的ISKpn26，并在兩端形成4 bp大小的正向重復(fù)序列，見圖2。其他基因pmrA、pmrB、pmrC、phoP、phoQ中未檢出已知的多黏菌素耐藥有關(guān)的基因突變。

注：A，mcr-9擴增產(chǎn)物部分電泳分析：1，陰性對照；2，陽性對照；3，待測菌株；M，DL 2000 marker。B，mcr-1擴增產(chǎn)物部分電泳分析：1，待測菌株；3，陰性對照；2，陽性對照；M，DL2000 marker。

圖2 mgrB ISKpn26插入序列

2.5實時熒光定量PCR結(jié)果 對大腸埃希菌和陰溝腸桿菌外的多黏菌素耐藥肺炎克雷伯菌菌株進行RT-qPCR檢測。與同期臨床分離的多黏菌素敏感肺炎克雷伯菌株P(guān)S1相比，8株多黏菌素耐藥肺炎克雷伯菌的pmrA、pmrC、pmrK、phoQ基因表達水平均明顯上調(diào)(P<0.01)，見圖3。

注：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。

3 討論

多項研究報道了在CRE中檢測到多黏菌素耐藥，并與其他耐藥基因(blaNDM-1、blaNDM-5、blaNDM-9、blaKPC-2、blaKPC-3、blaOXA-48、blaOXA-181)共存[10]。本研究通過對蘇州、成都、北京3個地區(qū)的341株CRE菌株進行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)在沒有使用多黏菌素的情況下，有3.2%的CRE已經(jīng)對多黏菌素耐藥，且對臨床常用大多數(shù)抗菌藥物高度耐藥(>70%)，提示在臨床實踐中應(yīng)警惕這些已經(jīng)存在的多黏菌素耐藥菌株，避免其進一步傳播。

目前，腸桿菌科對多黏菌素耐藥主要分為染色體和質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥機制。最近研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥基因mcr已通過水平轉(zhuǎn)移傳播到各種生態(tài)系統(tǒng)，包括水、土壤、植物、動物和公共場所。mcr-1是第一個被報道的質(zhì)粒攜帶的多黏菌素耐藥基因，通過修飾脂多糖上脂質(zhì)A的4′-磷酸乙醇胺介導(dǎo)對黏菌素的耐藥[11]。本研究在2株大腸埃希菌中檢測到mcr-1基因，其多黏菌素的MIC值為8 μg/mL，解釋了其對多黏菌素耐藥的機制。

隨后發(fā)現(xiàn)了一系列mcr基因，例如mcr-1.2～mcr-1.13、mcr-2～mcr-2.9和mcr-3～mcr-9。有研究表明，mcr-9基因編碼磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶，與其他已知的質(zhì)粒編碼的MCR(MCR-1～ MCR-8)具有33%～65%的同源性。MCR-9功能與MCR-1類似，即在脂質(zhì)A中加入磷酸乙醇胺基團，對脂多糖的結(jié)構(gòu)進行修飾，在自然狀態(tài)下對多黏菌素敏感性影響較小，在多黏菌素的誘導(dǎo)下可產(chǎn)生高水平的耐藥[12]。另一項研究表明mcr-9在大腸埃希菌中可導(dǎo)致MIC值較低的多黏菌素耐藥[13]。本研究中1株陰溝腸桿菌中攜帶mcr-9基因，其MIC值為4 μg/mL，且未發(fā)現(xiàn)與多黏菌素耐藥有關(guān)的突變，mcr-9可能為該菌株對多黏菌素耐藥的機制。

染色體介導(dǎo)的耐藥機制由phoPQ和pmrAB雙組分系統(tǒng)調(diào)控，該系統(tǒng)可響應(yīng)低鎂濃度和其他環(huán)境刺激(包括暴露于多黏菌素)，使4-氨基-4-脫氧-L-阿拉伯糖(L-Ara4N，由pmrHFIJKLM-ugd調(diào)控)和/或磷酸乙醇胺(pEtN，由pmrC調(diào)控)對脂質(zhì)A進行修飾，減少細菌表面的陰離子電荷，導(dǎo)致多黏菌素與細菌外膜的靜電結(jié)合減少。腸桿菌科細菌主要通過破壞涉及雙組分系統(tǒng)的基因，使細菌獲得多黏菌素耐藥性。MgrB是一種小的跨膜蛋白質(zhì)，對PhoPQ具有負反饋調(diào)節(jié)作用。mgrB中插入序列或突變會導(dǎo)致MgrB蛋白失活，消除對PhoP/PhoQ調(diào)節(jié)系統(tǒng)的負反饋，并導(dǎo)致多黏菌素耐藥[14]。本研究檢測到1株肺炎克雷伯菌存在mgrB的插入，進一步RT-qPCR結(jié)果顯示，8株多黏菌素耐藥肺炎克雷伯菌的pmrA、pmrC、pmrK、phoQ基因表達水平都明顯上調(diào)(P<0.01)，包括7株未發(fā)現(xiàn)上述mcr基因以及已知耐藥調(diào)控基因突變的菌株，表明這些菌株可能由于上調(diào)pmrCAB和pmrHFIJKLM操縱子的表達，導(dǎo)致發(fā)生脂多糖修飾，從而導(dǎo)致多黏菌素耐藥。

未使用多黏菌素的患者出現(xiàn)多黏菌素耐藥的機制仍不清楚，在非克隆傳播的情況下，可能由于質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥性水平傳播。氯己定是醫(yī)院常用的消毒劑，有研究表明暴露于氯己定可導(dǎo)致脂多糖修飾以及相關(guān)膜蛋白表達的改變，從而導(dǎo)致多黏菌素耐藥[15]。此外，編碼ESBLs或碳青霉烯酶的基因轉(zhuǎn)座可破壞mgrB基因，從而導(dǎo)致對多黏菌素耐藥。食用動物中的耐藥菌也可通過食物鏈傳播到人類[16]。

本研究由于收集的菌株數(shù)量有限，尚不能完全反映多黏菌素耐藥CRE的流行情況和耐藥機制。但從以上數(shù)據(jù)可以得出，即使在未使用多黏菌素的情況下，仍有3.2%的CRE對多黏菌素耐藥，其機制主要與染色體和質(zhì)粒介導(dǎo)有關(guān)。提示臨床隨著多黏菌素的應(yīng)用，多黏菌素耐藥菌株可能會被篩選并傳播，因此應(yīng)加強細菌耐藥監(jiān)測和抗菌藥物管理，延緩多黏菌素耐藥性的發(fā)展，為抗菌藥物的療效和安全性提供保障。