巢蓓，范小杰，姚玉華，周寅，史梅，彭陽，周圍，馬錦洪，史偉峰

(蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇常州 213003)

2019年底武漢發(fā)生原因不明的冠狀病毒感染，經(jīng)基因序列分析發(fā)現(xiàn)該病毒與SARS-CoV屬同一病毒屬，遺傳上非常相近，因而國(guó)際病毒分類學(xué)委員會(huì)宣布這種病毒的英文名為“SARS-CoV-2”[1-2]。SARS-CoV-2與2種2018年采集自中國(guó)舟山的蝙蝠來源SARS樣冠狀病毒bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21的相似度大于85%，但與SARS-CoV(相似度79%)和MERS-CoV(相似度50%)相差較大[3]。受患者病程、采樣質(zhì)量、檢測(cè)試劑靈敏度及人員操作的熟練程度等影響，SARS-CoV-2核酸的檢出率僅為38%[4]，而血清學(xué)抗體具有操作簡(jiǎn)便、成本低、靈敏度及特異性較好等特點(diǎn)，《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》已將抗體檢測(cè)列入疑似病例確診或排除的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一[5]。鑒于2種檢測(cè)方法各自特點(diǎn)，應(yīng)將SARS-CoV-2核酸檢測(cè)和血清學(xué)試驗(yàn)相結(jié)合，以提高檢出率，降低假陰性和假陽性結(jié)果。本研究選取4 825例入院患者，采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測(cè)，并對(duì)抗體陽性患者進(jìn)行核酸復(fù)檢，分析抗體檢測(cè)假陽性的因素，為疫情防控提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 收集2020年3月17日至4月20日本院入院患者共4 825例，其中女性2 653例，男性2 172例，年齡8～92(52±31)歲。采集靜脈血3 mL，置于含分離膠的真空采血管內(nèi)，靜置待血液凝固，4 000×g離心5 min，排除脂血、溶血等不合格標(biāo)本。咽拭子標(biāo)本由指定人員采集，將拭子折斷后置于含有1.5 mL病毒保存液的保存管中，用密封袋包裝，置于專用轉(zhuǎn)運(yùn)箱由專人運(yùn)送至PCR實(shí)驗(yàn)室。靜脈血和咽拭子標(biāo)本均入院即采集。

1.2儀器與試劑 MAGLUMI X8化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(深圳新產(chǎn)業(yè)公司)，DA3200核酸提取儀(中山大學(xué)達(dá)安公司)，ABI 7500 型熒光定量PCR 儀(美國(guó)賽默飛公司)；SARS-CoV-2 IgM、IgG抗體檢測(cè)試劑盒(深圳新產(chǎn)業(yè)公司)，核酸擴(kuò)增試劑(江蘇碩世公司)。

1.3血清IgM和IgG抗體檢測(cè) IgM抗體用化學(xué)發(fā)光免疫捕獲法，IgG抗體用化學(xué)發(fā)光免疫間接法，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。通過光電倍增管檢測(cè)相對(duì)光強(qiáng)度(RLU)，RLU與標(biāo)本(或校準(zhǔn)品/質(zhì)控品)中SARS-CoV-2 IgM或IgG濃度呈正相關(guān)關(guān)系，檢測(cè)結(jié)果>1.0 AU/mL為有反應(yīng)性(陽性)。

1.4RNA 提取和擴(kuò)增 待測(cè)標(biāo)本56 ℃ 30 min滅活后，按照試劑說明書，在DA3200核酸提取儀上用磁珠法提取。用ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，F(xiàn)AM通道為開放讀碼框1ab(ORF1ab)基因，VIC通道為N基因，CY5通道為內(nèi)標(biāo)。反應(yīng)體系共25 μL，包括15 μL反應(yīng)液、5 μL酶、5 μL核酸提取液。反應(yīng)參數(shù)：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄10 min；97 ℃預(yù)變性1 min；97 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。結(jié)果判定：FAM和VIC通道同時(shí)檢測(cè)到典型的S型擴(kuò)增曲線且循環(huán)閾值(Ct)≤37，判為陽性；所有通道Ct>40或未檢出，判斷為陰性；有1個(gè)通道結(jié)果Ct≤37，其他1個(gè)通道檢測(cè)結(jié)果37

2 結(jié)果

2.1IgM和IgG抗體檢測(cè)結(jié)果 4 825例血清標(biāo)本中，有111例IgG抗體陽性[濃度為(4.57±6.53) AU/mL]，4 714例IgG抗體陰性[濃度為(0.36±0.25) AU/mL]；有11例IgM抗體陽性[濃度為(1.32±0.34) AU/mL]，4 814例IgM抗體陰性[濃度為(0.21±0.20) AU/mL]。

11例IgM陽性及111例IgG陽性入院患者均用熒光定量PCR檢測(cè)咽拭子標(biāo)本中SARS-CoV-2核酸，結(jié)果均為未檢出。對(duì)檢測(cè)抗體陽性的患者進(jìn)行流行病學(xué)史調(diào)查,均無疫區(qū)旅行或居住史，無感染者接觸史。臨床表現(xiàn)均排除發(fā)熱和/或呼吸道癥狀、肺炎影像學(xué)特征、發(fā)病早期白細(xì)胞總數(shù)正?；蚪档汀⒘馨图?xì)胞計(jì)數(shù)減少中任意2條。均判抗體檢測(cè)結(jié)果為假陽性。IgM抗體假陽性率為0.23%，其中男性0.27%(6/2 172)，女性0.19%(5/2 653)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而IgG抗體假陽性率為2.30%，其中男性2.62%(57/2 172)，女性2.04%(54/2 653)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2不同年齡段IgM和IgG抗體假陽性率分析 IgM假陽性率較低，主要分布在51～80歲年齡段。<20歲、21～30歲、31～40歲和41～50歲4個(gè)年齡段的患者IgG抗體假陽性率均<1%，各年齡段間差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。隨著年齡的增加，IgG抗體假陽性率也逐漸增加。50歲以下患者1 471例，IgG抗體假陽性率為0.75%(11/1 471)；>50歲患者3 354例，IgG抗體假陽性率為2.98%(100/3 354)，>50歲年齡組明顯高于<50歲組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=23.63，P<0.001)。見表1。

表1 不同年齡段患者IgM和IgG抗體假陽性結(jié)果[n(%)]

2.3不同病種IgM和IgG抗體假陽性率分析 IgM假陽性11例，包括腫瘤2例、糖尿病1例、血液病1例、甲狀腺結(jié)節(jié)1例等。617例腫瘤患者中IgG檢出64例，假陽性率為10.37%，包括肺癌13例、乳腺癌13例、胃癌10例、食管癌9例、結(jié)直腸癌8例、卵巢癌2例、其他腫瘤9例；呼吸道感染、血液病、慢性腎衰竭、風(fēng)濕病、腦梗死、骨折等患者的IgG假陽性率分別為5.00%、3.72%、3.01%、1.55%、1.43%、0.68%，見表2。111例IgG假陽性病例中，腫瘤患者占57.66%，血液病患者占10.81%，腦梗死、慢性腎衰和呼吸道感染患者各占3.60%，風(fēng)濕病和骨折各占2.70%，皮膚病1.80%，其他疾病14.41%。

表2 不同病種IgG抗體檢測(cè)的假陽性率

3 討論

SARS-CoV-2 ORF1ab為RNA依賴的RNA聚合酶基因(RdRp)所在區(qū)域，編碼RNA聚合酶，負(fù)責(zé)病毒核酸復(fù)制；S區(qū)編碼棘突蛋白，依賴其與細(xì)胞表面血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)和絲氨酸蛋白酶TMPRSS2進(jìn)入宿主細(xì)胞；E區(qū)編碼囊膜蛋白，負(fù)責(zé)病毒包膜及病毒顆粒的形成；M區(qū)編碼膜蛋白；N 區(qū)編碼核殼蛋白，與病毒基因組宿主RNA互相識(shí)別[6-8]。由于SARS-CoV-2的RdRp基因在進(jìn)化樹上與 SARS-CoV的RdRp基因顯著不同，故被列為一種全新的β屬冠狀病毒。因而，RdRp基因也成為鑒定SARS-CoV-2核酸的一個(gè)重要標(biāo)志物?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案(試行第七版)》中新型冠狀病毒肺炎的實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù)包括病毒核酸熒光定量PCR檢測(cè)、全基因組序列同源性分析、IgG及IgM抗體檢測(cè)[5]。

新型冠狀病毒肺炎通常表現(xiàn)為發(fā)熱、干咳、呼吸困難等肺炎樣癥狀，前期具有隱匿性，其癥狀與普通感冒相似，部分無癥狀感染者不易鑒別，給疫情控制帶來極大的困難。核酸檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜，假陰性率高達(dá)50%。 徐萬洲等[9]用化學(xué)發(fā)光法(深圳亞輝龍公司試劑)檢測(cè)SARS-CoV-2特異性IgM抗體的敏感性和特異性分別為70.24%和96.2%，而IgG抗體則分別為96.1%和92.41%。免疫層析法IgM/IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)的敏感性和特異性為88.66%和90.63%[10]，化學(xué)發(fā)光法具有操作簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高，適用于大批量標(biāo)本的檢測(cè)。

本文選擇4 825例入院患者，采用化學(xué)發(fā)光法同時(shí)檢測(cè)其血清IgM抗體和IgG抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)11例IgM抗體陽性，111例IgG抗體陽性，IgM、IgG抗體假陽性率分別為0.23%和2.3%。男性、女性IgG抗體假陽性率分別為2.62%和2.04%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明抗體假陽性與性別無關(guān)。<20歲、21～30歲、31～40歲和41～50歲4個(gè)年齡段共1 471例患者的IgG抗體假陽性率均<1%，3 354例>50歲患者的IgG抗體假陽性率為2.98%，>50歲年齡組假陽性率高于<50歲組(P<0.001)。提示隨著年齡的上升，IgG抗體假陽性率明顯升高。推測(cè)由于50歲以上的人群患病概率升高，血液中存在治療藥物、類風(fēng)濕因子、異嗜性抗體、自身抗體、腫瘤細(xì)胞等內(nèi)源性干擾物質(zhì)，影響抗體的檢測(cè)。

617例腫瘤患者中IgG檢出64例，假陽性率為10.37%；323例血液病患者IgG檢出12例，假陽性率為3.72%；193例風(fēng)濕病患者中檢出3例，假陽性率為1.55%。而在111例IgG假陽性病例中，腫瘤、血液病、風(fēng)濕病分別占57.66%、10.81%和2.7%。腫瘤、血液病患者由于免疫力低下，感染其他冠狀病毒的概率高，同時(shí)治療過程中使用化療藥物和其他藥物較多，可能對(duì)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)產(chǎn)生干擾，造成IgG抗體假陽性高。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1例57歲風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者，類風(fēng)濕因子(RF) 2 835 IU/L、SARS-CoV-2 IgG抗體2.29 AU/mL；另外1例48歲SLE患者，RF 26.4 IU/L，血清IgG 19.4 g/L，抗Sm抗體、抗著絲點(diǎn)B抗體、抗核小體抗體、抗組蛋白抗體、抗心磷脂抗體、抗SSA(Ro60)抗體和抗U1-nRNP抗體均陽性，SARS-CoV-2 IgG抗體達(dá)45.9 AU/mL。RF主要為IgM類自身抗體，但也有IgG類、IgA類、IgD類和IgE類，具有與變性IgG 產(chǎn)生非特異性結(jié)合的特點(diǎn)，可與固相包被的特異性抗體IgG以及隨后加入的標(biāo)記特異性抗體IgG結(jié)合，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。推測(cè)自身抗體和RF對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。由于條件限制，干擾機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

研究表明，SARS-CoV-2感染人體5～7 d后產(chǎn)生IgM抗體，10～15 d后產(chǎn)生IgG抗體。由于IgM和IgG抗體出現(xiàn)時(shí)間、各種試劑及儀器檢測(cè)靈敏度及特異性的差異，抗體聯(lián)合檢測(cè)雖能提高診斷的靈敏度和特異性，但仍將導(dǎo)致較多的假陰性和假陽性結(jié)果[11]。因此，血清或血漿中的SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體僅適用于SARS-CoV-2 核酸檢測(cè)陰性的疑似病例的補(bǔ)充檢測(cè)，或疑似病例診斷中與核酸檢測(cè)協(xié)同使用，不能作為新型冠狀病毒肺炎確診及排除依據(jù)，不可用于復(fù)工復(fù)產(chǎn)復(fù)學(xué)人群或一般人群篩查，否則易導(dǎo)致漏檢或造成社會(huì)恐慌，給疫情防控帶來極大困擾。