林凡友,孫永喜,陳仁燕
(翔宇藥業(yè)股份有限公司,山東 臨沂 276023)
斷血流是一種民間傳統(tǒng)用藥,含有多種化學(xué)成分,具有止血、抗菌、降血糖、抗氧化、抗炎等藥理作用,臨床上主要應(yīng)用于治療各種出血癥[1-2]。斷血流口服液是由斷血流藥材經(jīng)提取濃縮等工藝制成的口服液,具有涼血止血的功效。適用于血熱妄行的出血證候,用于功能性子宮出血,產(chǎn)后出血,子宮肌瘤出血,單純性紫癜,原發(fā)性血小板減少性紫癜系血熱妄行者[3]。目前現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)是原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)(WS-546(X-079)-2000-2016Z),其中斷血流口服液含量檢測(cè)方法為薄層掃描法,目前廣泛用于測(cè)定斷血流皂苷含量的方法有高效液相色譜法[4-5]、紫外分光光度計(jì)法[6],為提高斷血流口服液含量檢測(cè)的準(zhǔn)確性,試驗(yàn)制定了高效液相色譜(HPLC)法檢測(cè)斷血流口服液中的斷血流皂苷A,并對(duì)該含量測(cè)定方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。試驗(yàn)表明,該方法簡(jiǎn)單,可以有效地檢測(cè)斷血流口服液中斷血流皂苷A的含量,準(zhǔn)確地控制制劑有效成分,保證產(chǎn)品質(zhì)量。
Agilent 1260高效液相色譜儀(紫外檢測(cè)器,型號(hào):G1314F,美國(guó)安捷倫公司);AUW220D型電子天平。斷血流皂苷A對(duì)照品(批號(hào):110782-200602)來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲醇、乙腈為色譜純,來(lái)源于美國(guó)天地有限公司;水為純化水;其他試劑均為分析純。斷血流口服液樣品來(lái)源于翔宇藥業(yè)股份有限公司。
2.1 色譜條件 色譜柱為C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相為甲醇-水(75∶25),檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm,流速1.0 mL·min-1,柱溫為25 ℃,進(jìn)樣量為20 μL。理論板數(shù)按斷血流皂苷A峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。
2.2 溶液的制備
2.2.1 供試品溶液的制備 取斷血流口服液適量(批號(hào):200401),精密量取本品1 mL,加水24 mL,搖勻,置分液漏斗中,加水飽和的正丁醇振搖提取4次,每次20 mL,合并正丁醇液,用正丁醇飽和的氨試液30 mL洗滌,再用正丁醇飽和的水洗滌2次,每次30 mL,取正丁醇蒸干,殘?jiān)眉状既芙猓D(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。
2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 稱取五氧化二磷減壓干燥器內(nèi)干燥12 h的斷血流皂苷A對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含500 μg的溶液,即得對(duì)照品貯備溶液,精密吸取對(duì)照品貯備液適量,加甲醇制成每1 mL含10 μg的溶液,即得對(duì)照品溶液。
2.2.3 陰性供試品溶液制備 取不含斷血流藥材的陰性樣品適量,同供試品溶液制備處理方法,配制成陰性供試品溶液。
2.3 專屬性試驗(yàn) 分別精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各20 μL,用高效液相色譜儀測(cè)定,如圖1。在該色譜條件下陰性樣品對(duì)樣品峰沒(méi)有干擾;主峰保留時(shí)間在20 min左右,理論板數(shù)按斷血流皂苷A峰計(jì)算大于3 000,說(shuō)明該方法專屬性良好。
圖1 斷血流口服液專屬性試驗(yàn)HPLC色譜圖
2.4 線性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量分別置于10 mL量瓶中,加甲醇溶液稀釋制成濃度分別為2.21、6.63、8.84、11.05、16.58、22.1 μg·mL-1的溶液,分別作為20%、60%、80%、100%、150%、200%的線性溶液,依法測(cè)定斷血流皂苷A的含量。以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由試驗(yàn)結(jié)果可知,斷血流皂苷A含量在2.21~22.1 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi),線性方程為Y=32.493X+1.241 3,r=0.999 9(n=6),峰面積和濃度均呈現(xiàn)良好線性關(guān)系,結(jié)果見圖2。
圖2 斷血流皂苷A含量測(cè)定線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
2.5 系統(tǒng)精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液,重復(fù)測(cè)6次,并記錄色譜圖。結(jié)果表明:峰面積的RSD值為0.27%,表明該方法的系統(tǒng)精密度良好。
2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取一批樣品6份,按供試品制備方法制備供試品溶液,依法測(cè)定,計(jì)算含量為0.816 mg·mL-1,含量RSD為1.83%,表明該方法的重復(fù)性較好。
2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將供試品溶液于室溫條件下放置12 h,分別于0、1、2、4、6、8、10、12 h測(cè)定。結(jié)果表明,在室溫條件下放置12 h內(nèi),測(cè)得供試品峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.40%,表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取斷血流口服液樣品(批號(hào):200401,斷血流皂苷A含量為0.816 mg·mL-1)適量,每個(gè)容量瓶中分別精密加入0.5 mL,共9份,分別加入適量對(duì)照品溶液與供試品中待測(cè)成分含量之比為0.5∶1、1∶1、1.5∶1,依法測(cè)定,如表1。由試驗(yàn)結(jié)果可知,含量測(cè)定各濃度下回收率在98.49%~101.51%范圍內(nèi),平均值為99.66%,RSD為1.12%,表明該方法回收率良好。
表1 斷血流口服液含量測(cè)定回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)
2.9 耐用性試驗(yàn) 分別考察了標(biāo)準(zhǔn)色譜條件及柱溫(20、30 ℃)、流速(0.9、1.1 mL·min-1)、 流動(dòng)相比例(73∶27~77∶23)、不同品牌柱子(迪瓦、月旭、熱電)條件下,分別測(cè)定含量。結(jié)果表明,在柱溫、色譜柱、流動(dòng)相比例及流速等變動(dòng)因素有微小變化
時(shí),斷血流皂苷A含量RSD為1.13%,斷血流皂苷A含量測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果均基本沒(méi)有變化,表明該方法的耐用性良好。
2.10 樣品含量測(cè)定 取3批斷血流口服液,依法測(cè)定斷血流皂苷A含量,結(jié)果如表2所示。
表2 斷血流口服液樣品中斷血流皂苷A含量測(cè)定結(jié)果
3.1 流動(dòng)相考察 考察了流動(dòng)相甲醇-水(71∶29)[7]、甲醇-水(75∶25)[8-9]、甲醇-0.5%磷酸(75∶25)[10],經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),流動(dòng)相為甲醇-0.5%磷酸(75∶25)時(shí),在峰前有個(gè)小鼓包且基線不平,流動(dòng)相為甲醇-水(71∶29)時(shí),斷血流皂苷A含量較流動(dòng)相為甲醇-水(75∶25)時(shí)低,流動(dòng)相為甲醇-水(75∶25)時(shí)斷血流皂苷A峰對(duì)稱性好,基線平,雜峰少,能準(zhǔn)確檢測(cè)斷血流皂苷A色譜峰。
3.2 波長(zhǎng)的選擇 通過(guò)對(duì)斷血流皂苷A對(duì)照品溶液的紫外吸收全波長(zhǎng)掃描,確定在250 nm處,斷血流皂苷A有最大吸收,故選用250 nm作為高效液相色譜檢測(cè)波長(zhǎng)。
斷血流口服液是純中藥制劑,安全有效、副作用小,其所含成分復(fù)雜,經(jīng)藥理和臨床試驗(yàn)證明,其皂苷類成分對(duì)于止血具有治療出血的作用,因此選擇檢測(cè)斷血流皂苷A來(lái)控制斷血流口服液有效成分及樣品質(zhì)量[11]。本文采用高效液相色譜法測(cè)定斷血流口服液中的斷血流皂苷A的含量,操作簡(jiǎn)單,含量準(zhǔn)確,靈敏度高,耐用性強(qiáng),能準(zhǔn)確控制藥物的質(zhì)量,可以作為檢測(cè)斷血流口服液中斷血流皂苷A的含量。