張喜武，田瑩瑩，李秋晗，2，白玉峰，朱瑜，竇金金

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省康效中醫(yī)藥研究有限公司，黑龍江 哈爾濱 150040；3.哈爾濱成程生命與物質研究所，黑龍江 哈爾濱 150500；4.哈爾濱團簇現代中醫(yī)健康服務有限公司，黑龍江 哈爾濱 150500；5.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)具有高度的傳染性，除人與人傳染外，更體現在機體臟腑之間的傳染，最終導致多臟器受損甚至臟器衰竭，基于此,可運用五臟同補的中藥或者方劑進行治療，達到對癥治療的目的。人參為“百草之王”，是一種滋補強壯的藥物，2015版《中國藥典》記載，人參具有大補元氣、生津固發(fā)、補脾益肺、安神益智等功效，《神農本草經》中記載，人參具有“主補五臟……除邪氣……”的功效，如生脈散可用于新型冠狀病毒肺炎恢復期治療[1]。

G-CQDS是以人參根為原料，采用超音速對撞粉碎和光電碳化技術，制備成人參碳量子點膠體，因其碳化集聚可負載大量電荷，能夠進一步提高人參“適應原樣”作用。G-CQDS已在市場應用5年之多，具有較強抗腫瘤和提高免疫力作用，現已被黑龍江省科技廳列入創(chuàng)新產品目錄。在疫情期間，積極響應國家號召，為多家社區(qū)免費贈送了大量的G-CQDS，旨在提高人體免疫力，降低被COVID-19傳染的風險，依據使用跟蹤表統(tǒng)計結果，目前使用該產品的人群中未有被COVID-19感染者。由于疫情等多因素限制，目前應用到COVID-19確診患者僅有2例，分別為何某某(女，武漢人，被武漢市第四醫(yī)院(古田醫(yī)院)收治，連續(xù)服用6 d，核酸檢測陰性出院)和李某某(男，武漢人，被武漢市中醫(yī)醫(yī)院收治，連續(xù)服用7 d，治愈出院)。

1 實驗材料與儀器

1.1 材料

SPF級ICR小鼠90只，18～22 g，雄性，購于黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物許可證號:SYXK(黑)2015-003。NCI-H1975肺癌細胞，由中國科學院干細胞庫提供。

1.2 試藥

G-CQDS溶液(生命波人參根飲液：201811190802，95 mL)，由哈爾濱團簇現代中醫(yī)健康服務有限公司提供，吉非替尼(181101，0.25 g)，購自阿斯利康制藥有限公司。

1.3 試劑及儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；雙抗(美國Hyclone公司)；磷酸鹽緩沖液PBS(北京Biotopped公司)；4%臺盼藍(北京雷根生物技術有限公司)；IL-6 、TNF-α酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；不銹鋼數顯卡尺(上海尺喜工量具有限公司)；低速離心機，型號：SC-04(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱，型號：HF90(上海力申科學儀器有限公司)；超凈臺，型號：BIOsafe12(上海力申科學儀器有限公司)；倒置顯微鏡，型號：CKX41SF(美國Philippines公司)。超音速對撞粉碎儀器(哈爾濱成程生命與物質研究所自制)，光電碳化儀器(哈爾濱成程生命與物質研究所自制)。

2 實驗方法

2.1 動物模型復制

60只SPF級ICR雄性小鼠皮下注射接種細胞懸液0.1 mL，即每只小鼠接種細胞數為5×106個/只。空白對照組10只SPF級ICR雄性小鼠皮下注射PBS磷酸鹽緩沖液 0.1 mL。

2.2 G-CQDS溶液制備與表征

將超音速對撞粉碎儀器氮氣流速設置為600 m/s，超高速對撞1～2次，將人參根(≤5年生)瞬間粉碎成超細粉末。將粉末與水混合后在光電碳化儀器進行加熱，溫度為120 ℃，人參粉末和水的質量比為1∶10，加熱時間為180 s，遠紅外線照射速度30/s，使其全部碳化分散于水中形成碳量子點膠體溶液。碳量子點顆粒通過JEM-2100型透射電鏡進行觀察，測定其外觀形態(tài)和粒徑大小。采用Nicolet 6700型傅立葉變換紅外光譜儀測試光譜，評估碳量子點的光學性質，采用熒光光譜儀(F-7000)，測定熒光發(fā)射光譜圖。

2.3 動物分組及給藥

建模后小鼠隨機分為G-CQDS治療組、吉非替尼組、模型組，每組20只；空白組10只，G-CQDS預防組20只。G-CQDS治療組以30倍濃縮(相當于人每天飲用24瓶)的飲液9.88 mL/(kg·d)灌胃；吉非替尼組0.032 5 g/(kg·d)灌胃；模型組、空白組以純凈水灌胃，灌胃劑量均為0.2 mL，連續(xù)灌胃18 d；G-CQDS預防組提前給藥34 d，劑量同給藥組，第35天皮下接種肺癌細胞懸液，繼續(xù)給藥。

2.4 考察指標

2.4.1 外觀觀察

觀察各組小鼠健康狀況、精神狀態(tài)、食欲、運動、毛發(fā)、大便及腫瘤生長情況等。

2.4.2 腫瘤體積

每天測量腫瘤體積(TV),其中a為長徑，b為短徑，腫瘤體積計算公式為腫瘤體積=1/2ab2。

2.4.3 相對腫瘤增殖率

各組根據腫瘤體積計算相對腫瘤體積RTV=Vt/V0，其中V0為分組給藥前(即d0)的腫瘤體積，Vt為每次測量時的腫瘤體積。抑瘤活性的評價指標為相對腫瘤增殖率(T/C)，即給藥組RTV與模型對照組RTV比值的百分比，T/C>60%為無效，≤60%并經統(tǒng)計學處理P<0.05為有效。相對腫瘤增殖率=TRTV/CRTV×100%。

2.4.4 體質量、胸腺指數及脾指數

稱量小鼠給藥前(即d0)的體質量及最后一次給藥后的體質量。最后一次給藥后，禁食不禁水，次日將小鼠摘眼球取血，處死，解剖，剝離胸腺、脾臟，稱重，計算胸腺指數及脾指數。胸腺指數=[小鼠胸腺重量(mg)/小鼠體質量(g)]×10；脾指數=[小鼠脾臟重量(mg)/小鼠體質量(g)]×10。

2.4.5 細胞因子IL-6、TNF-α

小鼠摘眼球取血，血靜置1～2 h，離心，取血清,采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定每組小鼠血清中IL-6(白細胞介素6)，采用競爭法(ELISA)檢測腫瘤壞死因子(TNF-α)的含量。

3 實驗結果

3.1 G-CQDS的制備與表征結果

高分辨電鏡照片顯示碳顆粒為無內部缺陷的完整晶體，碳量子點呈類球形單分散，直徑約為2～5 nm，見圖1a。圖1b為碳量子點的傅里葉紅外光譜，圖中3 439 cm-1處為羥基(-OH)的伸縮振動峰；2 923 cm-1與1443 cm-1處是C-H的特征吸收峰；1 725 cm-1處為C=O的伸縮振動峰；1 235 cm-1處的吸收峰表明存在C-O官能團；860 cm-1處表示存在C-C的伸縮振動；625 cm-1處表示可能有C-CO-C彎曲振動。圖1c為激發(fā)光波長不變情況下碳量子點的Emission Wavelength發(fā)射光譜，測定樣品發(fā)射出不同波長的熒光，波長為橫坐標，以其強度F為縱坐標作圖，325 nm激發(fā)波長下碳原子團簇/納米碳的熒光光譜，在325 nm激發(fā)波長下的熒光最大發(fā)射波長約為440 nm。圖1d為保持熒光發(fā)射波長不變碳原子團簇/納米碳Excitation Wavelength激發(fā)光譜，400 nm發(fā)射波長下納米顆粒的激發(fā)光譜，在400 nm發(fā)射波長下最大激發(fā)波長約為470 nm，說明納米顆粒表面含有較多-OH和-COOH。

圖1 a為采用水熱法制備的G-CQDS透射電鏡照片;b為石墨脈沖激光輻照制備的人參碳碳量子點膠體紅外吸收光譜(傅里葉紅外光譜);c為水熱法法制備的G-CQDS Emission Wavelength發(fā)射光譜;d為水熱法制備G-CQDS Excitation Wavelength激發(fā)光譜

3.2 外觀觀察結果

觀察小鼠外觀及生存狀態(tài)，G-CQDS治療組及預防組較模型組瘤體小，活潑好動，精神狀態(tài)良好，食欲良好，毛發(fā)光澤，大便性狀未見異常；吉非替尼組小鼠瘤體小，行動遲緩、不活潑，食欲欠佳，毛發(fā)暗淡無光澤；模型組與給藥組相比，瘤體較大；空白組小鼠健康狀況及精神狀態(tài)良好，食欲佳，行動靈活。

3.3 腫瘤體積(TV)結果

表1 各實驗組小鼠腫瘤體積

各組小鼠腫瘤體積如表1所示，吉非替尼和G-CQDS治療組腫瘤體積較模型組顯著減小，隨著給藥天數的增加，腫瘤體積先增大后減小。建模小鼠成瘤率100%，G-CQDS預防組小鼠成瘤率為35%。

3.4 相對腫瘤增殖率(T/C)結果

表2 各實驗組小鼠相對腫瘤增殖率的影響

G-CQDS治療組給藥10～13 d的相對腫瘤增殖率分別為57.24%、55.00%、28.14%、17.93%，均<60%，吉非替尼組給藥第13天相對腫瘤增殖率達到38.65%。見表2。

3.5 體質量、胸腺指數及脾指數結果

小鼠給藥前后體質量的變化如表3所示，G-CQDS治療組體質量增長量與模型組一致，說明G-CQDS對小鼠體質量無影響；吉非替尼組體質量變化比模型組小，可能與吉非替尼影響小鼠食欲有關；G-CQDS預防組體質量變化大，原因可能與給藥周期較長有關。

表3 各實驗組小鼠體質量、胸腺指數、脾指數的影響

小鼠胸腺指數、脾指數的測定如表3所示，吉非替尼組較模型組明顯降低胸腺指數和脾指數，其中脾指數更為顯著；G-CQDS治療組對小鼠脾指數的影響較大，G-CQDS預防組與模型組比較均能降低胸腺指數和脾指數(P<0.01)。

3.6 細胞因子IL-6、TNF-α檢測結果

表4 各實驗組小鼠IL-6、TNF-α的影響

試劑盒檢測結果顯示，G-CQDS預防組可以顯著降低IL-6的含量，吉非替尼、G-CQDS治療組及預防組與模型組比較均可升高TNF-α的含量，從而達到抑制腫瘤生長的作用。見表4。

4 結論

G-CQDS治療組與模型組比較腫瘤體積明顯減小，給藥第10天起相對腫瘤增殖率<60%，證明G-CQDS具有抗腫瘤作用，且起效速度較快。預防組成瘤率顯著降低，且預防組顯示出更好的療效，證實G-CQDS可以有效預防腫瘤形成。能明顯降低胸腺指數和脾指數，可能通過調節(jié)小鼠免疫功能達到抑制腫瘤生長的目的。G-CQDS治療組與預防組對小鼠外觀和生存狀態(tài)無任何不良影響，而吉非替尼陽性對照組對模型小鼠外觀和生存狀態(tài)影響較大，推測是由吉非替尼副作用導致的[2-3]。

人參具有“適應原樣”作用，能夠增強機體對有害因素的抵抗力。臨床中醫(yī)專家認為患者熱退后往往存在疲倦、舌少津等癥狀，表現為氣陰兩虛證，與眾多專家意見相同[4]，提示新冠肺炎患者核酸檢測陰性出院后，仍要繼續(xù)服用人參產品，盡快恢復新冠肺炎對身體造成的損傷。

超音速對撞粉碎和光電碳化儀器是由哈爾濱成程生命與物質研究所和北京航空航天大學國家重點實驗室合作自主研發(fā)并制造，其技術水平為國內領先，共耗資幾千萬元人民幣。超音速對撞技術采用高壓氣體和高速離心加速，將中藥粗顆粒以600 m/s的速度相向對撞，使其破碎成原子或分子團簇(小于5 mm)，懸浮在水溶液中。光電碳化技術是高壓放電產生的等離子體(弧光或閃電)作用在懸浮于水溶液中的團簇，使其碳化制成碳量子點溶膠的過程(直徑約為2～5 nm)。 碳量子點(CQDS)是近來出現碳納米材料家族的新成員，由于其有熒光穩(wěn)定性高且耐光漂白、激發(fā)光寬而連續(xù)、有水溶性好及在細胞中遷移快等特性，被認為是一種理想的生物醫(yī)用材料[5]。最新研究發(fā)現碳量子點具有提高T細胞能力以及誘導人肝癌細胞、骨肉瘤細胞凋亡的現象[6-9]，將傳統(tǒng)中藥制備成以碳量子點形式給藥，可大大能夠提高臨床療效。