徐海娥, 李潘, 張慧, 劉建輝, 袁冰, 侯大衛(wèi)

甲狀腺乳頭狀癌(thyroid papillary carcinoma, PTC)是甲狀腺癌中最常見的病理分型,其中腫瘤最大直徑<1 cm的乳頭狀癌被特指為甲狀腺微小乳頭狀癌(thyroid papillary microcarcinoma, PTMC)。甲狀腺癌發(fā)病率上升的速度明顯高于其他腫瘤,自2000年至2011年其發(fā)病率增加了近20倍,新增病例的絕大多數(shù)為PTMC,占甲狀腺癌總體發(fā)病率的50%以上[1]。PTMC總體預(yù)后較好,然而研究同樣發(fā)現(xiàn),部分PTMC的復(fù)發(fā)率及腫瘤相關(guān)死亡率在增加[2-3]。如果在晚期確診,其5年生存率<60%,復(fù)發(fā)率高達(dá)30%[4]。即使在相同的病理組,甲狀腺癌顯示出不同的臨床行為,在某些情況下,分化良好的癌癥比預(yù)期的更具侵略性,使之難以預(yù)測腫瘤的臨床行為[5]。因此,PTC在高危人群中的早期診斷具有挑戰(zhàn)性,發(fā)現(xiàn)新的、有效的生物標(biāo)記物是一個(gè)迫切的需求。

代謝組學(xué)可對生物樣本多組分混合物進(jìn)行定量分析,為理解生化網(wǎng)絡(luò)的組成及功能提供重要信息,已經(jīng)被應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物的識(shí)別、疾病治療效果評價(jià)的研究中[6-7]。目前關(guān)于PTC代謝組學(xué)的研究主要集中在甲狀腺癌各病理分型間,PTC與癌旁組織或與健康對照組血清的代謝組學(xué)研究[8-10]。關(guān)于PTC不同的生物學(xué)行為特征組(是否合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,是否是微小乳頭狀癌)及PTC階段性代謝特征鮮有報(bào)道。本研究對PTMC合并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(T1組)、PTMC未合并頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(T2組)、PTC合并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(T3組)、未合并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患部者(T4組)、健康對照者(HC組)血清進(jìn)行基于H-NMR技術(shù)代謝組學(xué)分析,通過非靶向代謝組學(xué)研究PTC的階段化代謝特征譜,進(jìn)行潛在生物標(biāo)志物的篩選。

1 資料與方法

1.1 樣品采集及制備 所用樣品均采集自南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科自2018年1月至2018年12月期間手術(shù)的甲狀腺癌患者和健康志愿者,均簽署知情同意書。觀察組納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)病理學(xué)證實(shí)的女性PTC患者,年齡18～65 歲。排除標(biāo)準(zhǔn):既往有甲狀腺疾病手術(shù)史;合并慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎或甲狀腺機(jī)能異常;有心血管疾病及其它內(nèi)分泌代謝性疾病;腫瘤復(fù)發(fā)或者有其它惡性腫瘤患者;有代謝藥物服藥史及妊娠婦或處于哺乳期婦女。健康對照組為同期手術(shù)的甲狀腺結(jié)節(jié)患者,采血時(shí)間為入院次日早晨。采集血樣在常溫下靜置1 h后離心,4 ℃3 000 r/min,離心10 min,取上層血清置入凍存管,于-80 ℃冰箱保存。剔除樣本量少或溶血樣本。共獲得PTMC合并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(T1組)9例,平均年齡(42.3±5.8)歲;PTMC未合并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(T2組)7例,平均年齡(41.9±7.3)歲;PTC合并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(T3組)11例,平均年齡(42.9±6.3)歲;PTC未合并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(T4組)5例,平均年齡(44.2±5.3)歲；納入健康對照(HC)組10例，年齡(42.0±5.3)歲。五組年齡呈正態(tài)分布，方差齊，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.148,P=0.963)。

1.2 血清1H-NMR檢測 待測血清樣本室溫下解凍,取200 μl血清,加入485 μl甲醇/水(4/0.85, v/v)均勻后再依次加入200 μl三氯甲烷及225 μl水,充分渦旋后冰上靜置10 min;以3 000 r/min離心10 min;吸取上層極性相,真空抽干后以備檢測。取重水配置的磷酸鹽緩沖液(100 mmol/L,pH=7.0)600 μl至編號后的EP樣品管中,充分渦旋溶解后, 3 000 r/min離心10 min,取550 μl上清加入核磁共振管(直徑:5 mm)中。H-NMR譜分析在Bruker AV 500 NMR譜儀上用5 mm PATXI 反向探頭進(jìn)行檢測,對應(yīng)的質(zhì)子共振頻率為500.18 MHz,其它參數(shù)如下:譜寬6 009.6 Hz,延遲時(shí)間0.3 s,混合時(shí)間0.1 s,線增寬因子1,累計(jì)掃描數(shù)128次,在弛豫延遲和混合期間采用預(yù)飽和照射壓制水峰,獲得的1H NMR譜圖。利用TopSpin 2.1軟件對譜圖進(jìn)行相位矯正和基線調(diào)整,其中TSP作為化學(xué)位移參考峰的內(nèi)標(biāo),設(shè)為0 ppm。通過使用Chenomx Suite軟件分析代謝物的化學(xué)位移來鑒定主要代謝物[11]。

1.3 數(shù)據(jù)處理及模式識(shí)別 利用ProMetabver 7.0軟件(MathsWorks, Natick, MA, USA)對H-NMR譜進(jìn)行基線調(diào)整及面積歸一化處理,以TSP作為化學(xué)位移參考峰的位置,設(shè)為0 ppm,對化學(xué)位移(δ: 0.2～10.0)進(jìn)行分段積分,將水峰所在的化學(xué)位移區(qū)域(δ:4.70～5.20)去除,積分間距為0.005 ppm。所得數(shù)據(jù)輸入SIMCA-P+V11.0軟件包(Umetric, Sweden)進(jìn)行分析。采用有監(jiān)管的偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)和正交校正的偏最小二乘法-判別分析(O-PLS-DA)分析方法對預(yù)處理的核磁圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別分析[11],以尋找具有顯著特征的代謝物。

2 結(jié)果

2.1 對照組血清提取物的典型核磁共振氫譜 本實(shí)驗(yàn)共鑒定出30種代謝產(chǎn)物,如亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、賴氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、酪氨酸,谷氨酸等氨基酸類化合物;Krebs循環(huán)中間體:琥珀酸;有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì):牛磺酸;儲(chǔ)能物質(zhì):β-葡萄糖、α-葡萄糖等。結(jié)果見圖1。

注：(1)異亮氨酸;(2)亮氨酸;(3)纈氨酸;(4)異丁酸;(5)乙醇;(6)3-羥基丁酸;(7)乳酸;(8)蘇氨酸;(9)丙氨酸;(10)賴氨酸;(11)乙酸鹽;(12)N-乙酰糖蛋白;(13)谷氨酸;(14)谷氨酰胺;(15)丙酮;(16)乙酰乙酸;(17)琥珀酸;(18)三甲胺;(19)肌酸;(20)磷酸肌酸;(21)膽堿;(22)磷酸膽堿;(23)?；撬?(24)甘氨酸;(25)β-葡萄糖;(26)α-葡萄糖;(27)酪氨酸;(28)組氨酸;(29)苯丙氨酸和(30)甲酸鹽圖1 健康對照組血液H-NMR譜圖

2.2 核磁共振氫譜數(shù)據(jù)的多變量統(tǒng)計(jì)分析 O-PLS-DA結(jié)果表明PTC各組(T1、T2、T3、T4)與健康對照組(HC)組樣本得分點(diǎn)顯示出較好的分離趨勢。和HC比較,T1組(合并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTMC患者)9種差異性代謝產(chǎn)物:丙二醇、乳酸、賴氨酸、醋酸、N-乙酰蛋白、谷氨酸、肌酸、葡萄糖、甘氨酸水平顯著升高(R2X=54.2%,Q2=0.690,見圖2A, 2C); T2組(未發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTMC患者)有6種差異性代謝產(chǎn)物:丙二醇、醋酸、乙醇、葡糖糖、甘氨酸及組氨酸水平顯著升高(R2X=49.1%、 Q2=0.580,見圖2B、2D)。T3組(合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC患者)共10種差異性代謝產(chǎn)物,除了乳酸、賴氨酸、谷氨酸之外,更多的與腫瘤相關(guān)的代謝產(chǎn)物(如丙氨酸、酪氨酸)水平增高(R2X=81.3%、 Q2=0.609圖3A、3C);此外, T4組(未發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC患者)中檢測到7種代謝產(chǎn)物:丙二醇、乙醇、乳酸、賴氨酸、N-乙酰蛋白、谷氨酸及肌酸代謝水平升高(R2X=61.2%、 Q2=0.661,見圖3B、3D)。其中T3組的模型的解釋度R2最高而T2組最低。

注：(1)丙二醇;(2)乳酸鹽;(3)賴氨酸;(4)乙酸鹽;(5)N-乙酰糖蛋白;(6)谷氨酸鹽;(7)肌酸;(8)葡萄糖;(9)甘氨酸;(10)乙醇;(11)組氨酸圖2 健康對照組與T1(A, C)、T2(B, D)組的H-NMR譜正交校正的偏最小二乘法-判別分析得分圖和載荷圖

注：(1)丙二醇;(2)乙醇;(3)乳酸;(4)丙氨酸;(5)賴氨酸;(6)N-乙酰糖蛋白;(7)谷氨酸;(8)葡萄糖;(9)未知;(10)酪氨酸和(11)肌酸圖3 健康對照組與T3(A, C)、T4(B, D)組的H-NMR譜正交校正的偏最小二乘法-判別分析得分圖和載荷圖

3 討論

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來的一門新興學(xué)科,可對生物體內(nèi)的所有代謝物特別是小分子代謝物進(jìn)行定性、定量分析[12-14]。代謝組學(xué)在腫瘤研究中占有重要地位,特定的代謝途徑的激活,如有氧酵解和谷氨酰胺分解代謝,已在一些腫瘤疾病中被發(fā)現(xiàn)[15-16]。這些特定的腫瘤代謝物小分子的改變,參與惡性腫瘤的發(fā)展[17]。甲狀腺腫瘤微環(huán)境中,乳酸是穿梭于癌細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的重要代謝物質(zhì),作為重要的碳源參與細(xì)胞增殖同時(shí)也是腫瘤血管生成的信號分子之一。丙氨酸是腫瘤細(xì)胞的“必需氨基酸”。丙氨酸的生成可激活谷氨酰胺分解代謝途徑,生成谷氨酸進(jìn)入TCA循環(huán),除了提供碳源,還提供氮源促腫瘤細(xì)胞增殖,激活腫瘤細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。有研究者利用核磁共振光譜(NMR)或質(zhì)譜技術(shù),發(fā)現(xiàn)葡萄糖、氨基酸和脂類的代謝的產(chǎn)物在甲狀腺惡性腫瘤與健康組織及癌旁組織相比較時(shí)出現(xiàn)代謝異常征[18-19]。但關(guān)于PTC不同行為特征組的代謝組學(xué)研究鮮有研究,尤其是PTMC。

本實(shí)驗(yàn)在基于1H-NMR構(gòu)建高靈敏度的O-PLS-DA模型中可以看到,由于甲狀腺腫瘤的存在這一主要因素導(dǎo)致了甲狀腺癌各組與HC都有著明顯的區(qū)分聚類趨勢。在甲狀腺癌發(fā)展的各個(gè)階段,代謝產(chǎn)物的分布都發(fā)生了獨(dú)特的變化,分別鑒定出9種、6種、10種和7種不同的代謝物。與HC比較,T2組(未合并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTMC患者)的血清代謝輪廓更為接近HC。我們可以看到,合并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC患者(T3組)一些常見的腫瘤標(biāo)志物如乳酸、谷氨酸、賴氨酸、丙氨酸和酪氨酸水平增加,但是T2組,這些腫瘤相關(guān)的代謝產(chǎn)物未能鑒別出來。對于這一有趣的結(jié)果,需增加樣本量進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

我們的研究結(jié)果初步表明,雖然不同階段的PTC患者(T1、T2、T3、T4)組,各腫瘤組之間通過O-PLS-DA模型分析,未有明顯的區(qū)分聚類趨勢,可能由于樣本量少及采用生物標(biāo)本時(shí)是血清而不是組織標(biāo)本。但是,HC與PTC各組間都得到了很好的區(qū)分,PTC在腫瘤發(fā)展的不同階段具有不同的代謝特征,并鑒定出多種不同的代謝產(chǎn)物來區(qū)分HC和不同階段的PTC患者,與報(bào)道的甲狀腺癌[20]相關(guān)的腫瘤代謝特征一致。血清代謝組學(xué)對于PTC早期診斷、預(yù)防及治療有參考意義。