徐 放，張衛(wèi)華，潘 文，楊會肖，楊曉慧，廖煥琴，徐 斌，朱報著，王裕霞

（廣東省森林培育與保護利用重點試驗室/廣東省林業(yè)科學研究院，廣東 廣州 510520）

【研究意義】我國木本花卉資源豐富、應(yīng)用廣泛，具有較大的市場潛力，僅廣東省木本花卉年產(chǎn)值就超過9億元。但不同木本花卉品種栽培條件差異較大，且近年來極端氣候發(fā)生頻率增加［1］，盲目引種栽培可能會因為氣候因素造成較大損失［2-3］?！厩叭搜芯窟M展】近年來，對抗寒性和抗旱性的研究逐步深入，基于生理指標對抗逆能力進行評定的研究體系已日趨成熟［4-5］，相對電導(dǎo)率（EC）和相對含水量（RWC）等已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各物種的抗逆研究中，取得了很好的效果，Deans等［6］對橡樹進行相對電導(dǎo)率的檢測，評價了在不同寒害條件下植株的損傷情況；Su等［7］和Sedaghat等［8］分別在黑麥草和冬小麥中利用相對含水量的檢測對不同家系的抗寒水平進行了評定。以往研究主要利用隸屬函數(shù)法評定抗逆性的強弱，如蘇李維等［9］利用多個生理指標的隸屬函數(shù)法對葡萄的抗寒能力進行了排序。但相關(guān)研究方法利用主成分分析減少生理表型的數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析時，部分測定數(shù)據(jù)無法發(fā)揮最大的統(tǒng)計效力，也無法利用由逆境處理時間或處理方式的變化而引起的生理數(shù)據(jù)的動態(tài)變化。將k-mean等統(tǒng)計方法引入抗逆研究中，可以為不同物種或品種抗逆能力的聚類提供了更為精準的分類手段，可以獲得更為直觀的抗逆性聚類，而且可以更充分利用測量得到的動態(tài)變化的生理數(shù)據(jù)［10］。在綜合評價的研究中，TOPSIS方法被廣泛應(yīng)用于工程［11］、數(shù)學［12］、醫(yī)療［13］等多個領(lǐng)域，引入抗逆行評價中可以豐富相關(guān)的研究方法?！颈狙芯壳腥朦c】到目前為止，我國南方地區(qū)主要栽培的木本花卉物種對低溫和干旱的抗性研究尚無報道，急需相關(guān)研究指導(dǎo)后續(xù)的引種和栽培?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為了比較和評價不同木本花卉植物的抗寒和抗旱能力，同時對不同物種的抗性進行準確排序和聚類，本研究選用27個木本花卉物種為研究材料，分析低溫和干旱脅迫比較不同逆境處理下的生理指標差異，首次在抗逆性研究中采用k-means方法對抗逆能力進行聚類并利用TOPSIS方法進行抗性排序，以期為木本花卉的引種和栽培應(yīng)用提供依據(jù)，也為抗逆性的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用27個物種的生長均一的種子苗作為試驗材料，包括黃花風鈴木（Handroanthus chrysanthus）、藍花風鈴木（Tabebuia pentaphylla）、金花風鈴木（T.rosea）、火焰木（Spathodea campanulata）、藍花楹（Grafton jacaranda）、本地木棉（Bombax malabaricum）、美麗異木棉（Ceiba speciosa）、廣寧紅花油茶（Camellia semiserrata）、杜鵑紅山茶（C.azalea）、小葉紫薇（Lagerstroemia indica）、大葉紫薇（L.speciosa）、黃槐（Cassia surattensis）、無憂木（Saracadives Pierre）、宮粉羊蹄甲（Bauhinia variegata）、紅花羊蹄甲（B.blakeana）、鐵刀木（Cassia siamea）、臘腸樹（C.f istula）、儀花（Lysidice rhodostegia）、鳳凰木（Delonix regia）、穗花棋盤腳（Barringtonia racemosa）、美花紅千層（Callistemon citrinus）、深山含笑（Michelia maudiae）、櫻花（Prunus serrulata）、紅樺銀樺（Grevillea banksii）、國慶花（Koelreuteria bipinnata）、澳洲火焰木（Brachychiton acerifolius）、紅花荷（Rhodoleia championii）。選擇地徑3.5 mm以上、株高20 cm以上、真葉展開8片以上的幼苗進行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗寒性試驗 低溫脅迫于2019年3月在華南農(nóng)業(yè)大學人工氣候箱（HP1000GS型）內(nèi)進行，光照強度為1 200 lx，光照時間為12 h，相對濕度保持在75%～85%。試驗苗木表面灰塵洗凈后放入人工氣候箱內(nèi)，以常溫（25 ℃）為對照，設(shè)9±1、6±1、3±1、0±1、-3（±1）℃等5個溫度梯度，以3 ℃/d降溫，當溫度降至某一設(shè)定溫度時，保持24 h，選擇第2～6展開葉進行測定，3次重復(fù)，每個重復(fù)1個單株。取樣時間均為上午8：00，采樣后繼續(xù)降溫（表1）。

表1 抗寒試驗人工氣候室降溫程序Table 1 Cooling procedure of cold resistance test in artificial climate chamber

1.2.2 抗旱性試驗 采用PEG水分脅迫模擬干旱處理，每個樹種選取3株生長一致的健壯苗木，3次重復(fù)，以單株為1個重復(fù)。試驗用1/2 Hoagland營養(yǎng)液和聚乙二醇6000（Polyethylene glycol 6000，PEG-6000）配制以下滲透勢的溶液：0 MPa（CK），－0.3 MPa（PEG-6000含量50 g/L），－0.5 MPa（PEG-6000含量150 g/L），－2.0 MPa（PEG-6000含量300 g/L）。苗木先在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中過渡48 h，洗凈后放入不同滲透勢的PEG溶液中，進行輕脅迫、中脅迫、強脅迫，每種脅迫分別處理12、24、36 h，以不加PEG的1/2 Hoagland營養(yǎng)液作對照。各處理均在室溫下進行，室內(nèi)溫度為26 ℃左右，相對濕度為75%～85%。不同樹種相同指標均選擇上午8：00同時取樣進行測定。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 電導(dǎo)率 取幼苗自上而下第2～6片展開葉，將葉片先用自來水輕輕沖洗除去表面的污物，然后用去離子水沖洗2遍，再用濾紙輕輕吸干葉片表面的水分，避開主葉脈，用打孔器打取3個直徑為0.8 cm的圓片，用去離子水沖洗3次，放入內(nèi)有20 mL去離子水的三角瓶中，室溫放置15 h，然后用電導(dǎo)儀（DDS-307型）在室溫下測定溶液的的電導(dǎo)率值（R），之后封住三角瓶口，在富華儀器有限公司生產(chǎn)的420型三用水箱中沸水浴30 min，以將組織全部殺死，冷卻至室溫后在同樣的條件下測定各瓶溶液的電導(dǎo)率值 （R1），以葉片殺死前的電導(dǎo)率占殺死后電導(dǎo)率的百分數(shù)表示膜的相對透性，計算相對電導(dǎo)率：

相對電導(dǎo)率（EC）＝R/R1×100

1.3.2 相對含水量（RWC） 采樣稱取鮮葉質(zhì)量后用蒸餾水浸泡24 h，然后稱飽和鮮質(zhì)量，最后在105 ℃下烘8 h稱干質(zhì)量，計算RWC：

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)利用R語言［14］agricolae程序包［15］和自編程序完成低溫處理下不同物種的生理指標進行單因素方差分析，對干旱處理的生理指標進行雙因素方差分析，并利用Duncan多重極差檢驗法進行多重比較。將不同物種在5個溫度下的RWC和EC指標值，使用NbClust程序包［16］，利用k-means方法分別進行聚類分析，并分別對比RWC和EC聚類結(jié)果的差異，提取出聚類有差異的物種進行第二次k-means聚類分析。以不同干旱脅迫程度和不同時間的9個RWC和EC指標值分別對各物種進行聚類，分析過程與低溫試驗數(shù)據(jù)分析相同。選擇0℃時的RWC和EC作為抗寒能力排序的指標，選擇強干旱脅迫下處理36 h的RWC和EC作為抗旱能力排序的指標，利用TOPSIS方法對各物種的抗寒和抗旱能力進行排序，首先利用R語言scale（）命令對不同指標進行歸一化處理，利用以下公式進行排序指標計算：

Ui=（ECi-ECMin）2+（RWCi-RWCMax）2

式中，ECi和RWCi分別為歸一化后各組數(shù)據(jù)的值，ECmin和RWCmax分別為歸一化處理后各數(shù)據(jù)的最小值和最大值，因EC與抗性呈負相關(guān)，RWC與抗性呈正相關(guān)，因此選擇ECmin和RWCmax作為標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫和干旱對木本花卉生理指標的影響

基于試驗測定，各物種不同逆境處理與對照條件下的生理指標見表2、表3和表4，對照不同樹種RWC在79.1%～109.2%之間，隨著處理溫度的降低，低溫處理各RWC指標逐步下降，其中大葉紫薇在-3 ℃處理后RWC值降至12.4%，為所有處理的最低值；對照EC在13.0%～39.8%之間，低溫處理中該指標隨著溫度的降低而逐漸升高，以紅花荷在-3 ℃處理后EC值最高，達到85.4%。干旱處理RWC和EC與低溫處理呈相同的變化趨勢，其中儀花在強干旱脅迫36 h后RWC值在所有檢測樣本中最低，降低至16.8%；所有樣本中，臘腸樹在干旱脅迫36 h后EC值最高，達到87.0%。

2.2 抗寒能力評價

由表3、圖1可知，基于27個樹種的RWC和EC指標，計算k-means聚類數(shù)均為2類，即抗寒和不抗寒兩個類群，第一次聚類時，小葉紫薇、大葉紫薇、黃槐、無憂樹、紅花羊蹄甲、儀花、紅花銀樺、國慶花8個物種在RWC和EC聚類中存在差異（圖1A、B），因此對上述8個物種進行第二次聚類，RWC和EC重新聚類結(jié)果8個物種被分為兩類且結(jié)果相同（圖1C、D）。在兩次聚類中，聚類1各物種在降溫至6℃時平均EC變化曲線顯示其電導(dǎo)率有較大的提升，相對含水量明顯下降，而聚類2在降溫至0℃前電導(dǎo)率變化幅度較小，降至0℃后電導(dǎo)率才有顯著提升，相對含水量也是在溫度降至0℃之后才出現(xiàn)明顯下降。因此，認為聚類1中的14個物種為不抗寒物種，聚類2中的13個物種為抗寒物種。

表2 27個物種低溫脅迫生理指標變化情況Table 2 Changes in physiological indicators of 27 species under low-temperature stress

表4 27個物種抗寒聚類情況Table 4 Clustering of cold resistance of 27 species

圖1 27個物種低溫脅迫下生理指標變化曲線與抗寒性聚類情況Fig.1 Physiological index change curve wder low-tempter ture stress and cold resistance ability clustering of 27 species

2.3 抗旱能力評價

由表5可知，基于干旱試驗中各物種的RWC和EC變化情況，利用Kmeans聚類結(jié)果顯示兩指標的最優(yōu)聚類數(shù)均為2，且各聚類內(nèi)包含的物種完全相同。由圖2可知，不同程度干旱脅迫下，聚類2物種的RWC和EC隨著時間的變化均顯示出更為明顯的變化，而聚類1的兩指標隨時間變化相對穩(wěn)定，且聚類2各物種的平均電導(dǎo)率高于聚類1、相對含水量低于聚類1。表明聚類1中17個物種為抗旱物種，聚類2中10個物種為不抗旱物種。

表5 27個物種抗旱聚類情況Table 5 Drought resistance ability clustering of 27 species

圖2 27個物種干旱脅迫下生理指標變化曲線與抗旱能力聚類情況Fig.2 Physiological index change curve under drought stress and drought resistance clustering of 27 species

2.4 抗寒和抗旱能力綜合評定

對RWC和EC表型進行歸一化處理后求得各物種的U值，其中抗寒U值最大的物種為黃花風鈴木（21.75），最小為杜鵑紅山茶（0），即杜鵑紅山茶抗寒能力最強，黃花風鈴木抗寒能力最弱；抗旱U值最大的物種為臘腸樹（30.50），最小為鐵刀木（0），即鐵刀木抗旱能力最強，臘腸樹抗旱能力最弱。各物種抗寒能力與抗旱能力U值和排序見表6?；诟魑锓N抗寒與抗旱能力的U值結(jié)果，以抗寒U值為橫坐標，抗旱U值為縱坐標，對所有物種的抗逆性進行綜合評定（圖3），可見其物種抗逆能力的分布情況。評價結(jié)果顯示山茶科兩個物種、千屈菜科兩個物種均呈現(xiàn)對低溫和干旱較好的抗性，有較好的向寒冷和干旱地區(qū)推廣的潛力。

表6 27個物種抗寒和抗旱能力排名Table 6 Ranking of cold and drought resistance ability of 27 species

圖3 27個物種抗寒和抗旱能力綜合評定Fig.3 Comprehensive evaluation of cold and drought resistance of 27 species

3 討論

植物葉片的電導(dǎo)率和相對含水量等生理指標是反映植物脅迫抗性的最直觀的指標［17-19］。研究表明，大多數(shù)常綠樹種難以長時間耐受0 ℃以下的低溫脅迫，短時低溫脅迫可恢復(fù)生長［20］。本研究中，溫度降低至6 ℃時，不抗寒物種的生理指標變化不明顯，并未出現(xiàn)較為嚴重的傷害；當溫度降至3 ℃時，抗寒物種與不抗寒物種的生理指標開始產(chǎn)生明顯差異；所有物種在溫度降至0 ℃以下時生理指標產(chǎn)生了明顯變化。因此，在種植非抗寒物種時應(yīng)注意避免6 ℃以下的低溫脅迫，種植抗寒物種時應(yīng)避免冰點以下脅迫，防止細胞液結(jié)冰造成細胞組織結(jié)構(gòu)的破壞，進而形成不可逆的傷害，育苗階段可通過改善農(nóng)藝設(shè)施增加保溫裝置的方法完成。

干旱是植物面臨的常見脅迫，植物大量失水后，引起大部分生理代謝的紊亂，短時間內(nèi)即可造成嚴重的不可逆?zhèn)?，耿云紅［21］的研究表明植物葉片電解質(zhì)損失超過50%后，即使恢復(fù)水分供應(yīng)，植物也將會受到永久損傷而無法完全恢復(fù)。本研究10個不抗旱物種的生理指標顯示在中度和重度干旱脅迫條件下，24～36 h階段內(nèi)，EC平均曲線快速升高，36 h后相對電導(dǎo)率均超過50%，RWC的平均變化曲線基本維持不變，說明這些物種在受到干旱脅迫24 h后已受到較嚴重的不可逆?zhèn)?，而抗旱樹種在干旱脅迫24 h后生理指標變化趨緩，表明各樹種對脅迫產(chǎn)生了一定程度的適應(yīng)性。因此，在進行木本花卉物種的苗期培育時，應(yīng)使用完善的培育設(shè)施如溫室、噴灌或滴灌等，以保證充足的水分供應(yīng)，不可使脅迫超過24 h，以免造成種苗的嚴重的損失。

k-means聚類方法是一種迭代求解的聚類分析算法［22］，已被利用在各個研究領(lǐng)域的聚類問題中［23-25］。本研究中引入k-means統(tǒng)計方法對動態(tài)變化的生理指標進行聚類用以推斷不同物種抵抗逆境的能力，取得了較好的效果，可以明顯看出對寒冷和干旱抗性差異明顯的物種在應(yīng)對脅迫中產(chǎn)生了不同的生理反應(yīng)過程，結(jié)合TOPSIS方法對各物種的抗寒和抗旱能力進行綜合排序，可以明確不同物種的抗逆程度，對引種和栽培提供了有力的指導(dǎo)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在不同的低溫脅迫和干旱脅迫下，27個物種的生理指標呈現(xiàn)出顯著的差異，葉片電導(dǎo)率隨著脅迫程度的加重和脅迫時間的增加而增加，相對電導(dǎo)率則呈現(xiàn)相反的變化。根據(jù)k-means聚類和TOPSIS綜合比較法分析表明，13個物種為抗寒物種，其中杜鵑紅山茶抗寒能力最強；17個物種為抗旱物種，其中鐵刀木抗旱能力最強。山茶科和千屈菜科物種呈現(xiàn)出較強的對低溫和干旱的綜合抗性；紫薇科和豆科類似，科內(nèi)的物種抗逆性差異較大；木棉科樹種抗旱能力較強，抗寒能力較差。