王玉林，原紅軍，扎桑，楊春葆，徐齊君

（省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所，西藏拉薩850032）

青稞（Hordeum vulgare var.nudum）是我國(guó)西部青藏高原常年種植的主要糧食作物和重要牲畜飼料來(lái)源[1]，約占該地區(qū)糧食播種面積的80%左右。但是，由于對(duì)青稞食品需求量的增加以及氣候變化的嚴(yán)重影響，青稞產(chǎn)量的提高對(duì)滿(mǎn)足青藏高原地區(qū)糧食消費(fèi)需求有著重要的意義[2]。青稞生長(zhǎng)在極端環(huán)境，因此對(duì)非生物脅迫有著獨(dú)特的適應(yīng)機(jī)理。

土壤鹽堿化是一種嚴(yán)重的非生物脅迫，影響作物生長(zhǎng)并造成世界范圍內(nèi)作物產(chǎn)量損失[3]。據(jù)估計(jì)，在未來(lái)幾十年中，鹽堿脅迫可能會(huì)影響越來(lái)越多的耕地[4]，并使植物遭到滲透脅迫、高pH脅迫和離子毒性。為了應(yīng)對(duì)高鹽堿脅迫，植物通過(guò)復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作出反應(yīng)，改變基因表達(dá)水平并參與膜運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和能量代謝相關(guān)的翻譯后修飾[5-6]。但是，目前對(duì)植物鹽堿反應(yīng)的分子機(jī)制了解甚少，提高農(nóng)作物的鹽堿耐受性是一個(gè)重要的全球性問(wèn)題。

MicroRNA（miRNA）屬于一類(lèi)小的單鏈RNA，它們?cè)谵D(zhuǎn)錄后水平上負(fù)調(diào)控基因表達(dá)[7]。許多研究表明，植物miRNA在應(yīng)對(duì)非生物脅迫中起重要作用[8-9]，如鹽堿脅迫[10-12]。近年來(lái)，miRNA在模式植物和幾種谷物中介導(dǎo)與脅迫適應(yīng)相關(guān)基因的調(diào)控通路[13]。研究表明，不同植物物種在鹽堿脅迫下可能具有不同的miRNA介導(dǎo)的調(diào)控策略。高通量測(cè)序技術(shù)已廣泛用于miRNA鑒定[13-15]，為青稞鹽堿響應(yīng)的miRNA檢測(cè)及研究提供了很好的技術(shù)支持。

本研究的目的是在青稞中鑒定鹽堿脅迫響應(yīng)相關(guān)的miRNA，預(yù)測(cè)其靶標(biāo)以及探索檢測(cè)到的miRNA的功能，并揭示miRNA的表達(dá)和調(diào)控模式。研究結(jié)果可為進(jìn)一步驗(yàn)證青稞在鹽堿脅迫下的miRNA-mRNA調(diào)控模式提供重要的信息，并為解析青稞和其他農(nóng)作物中鹽堿脅迫響應(yīng)的分子機(jī)理提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和鹽堿處理

本研究以青稞地方品種0119和0226作為材料，其中0119對(duì)鹽堿脅迫具有很高的抗性，而0226對(duì)鹽堿脅迫敏感[16]。用2%H2O2將種子表面滅菌30 min，再用無(wú)菌水沖洗，放在25℃的黑暗環(huán)境下潮濕的薄紙中2 d。然后將發(fā)芽的幼苗轉(zhuǎn)移至溫室中的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中，光溫條件分別為14 h（光照）/10 h（黑暗）和22℃（光照）/20℃（黑暗）。鹽堿脅迫處理，將2個(gè)材料的3周齡幼苗中的1/2移至添加了200 mmol/L Na+（NaHCO3和Na2CO3物質(zhì)的量之比為1∶1）的培養(yǎng)液中72 h。其余1/2植物作為對(duì)照生長(zhǎng)在Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中。

1.2 總RNA提取和miRNA文庫(kù)的構(gòu)建

分別取2個(gè)材料在鹽堿脅迫（2、8、24、48、72 h）和對(duì)照（0、2、8、24、48、72 h）處理后的植株新鮮葉片，使用Trizol試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，美國(guó)）從中提取總RNA，并使用RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen，Valencia，CA，美國(guó)）純化。RNA樣品的濃度和質(zhì)量使用Nano Drop 2000分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，Inc.）通過(guò)測(cè)量A260/A280和A260/A230的比例來(lái)確定。將純化的高質(zhì)量RNA溶于無(wú)RNase的水中。取10μg總RNA樣品，通過(guò)PAGE凝膠選擇8～30個(gè)核苷酸的RNA片段。將RNA片段連接至5'接頭和3'接頭，通過(guò)PAGE凝膠再次過(guò)濾片段大小。使用One Step Primer Script miRNA cDNA合成試劑盒（Trans Gen）對(duì)連接的RNA進(jìn)行RT-PCR，產(chǎn)生cDNA產(chǎn)物。cDNA文庫(kù)通過(guò)凝膠純化，并用安捷倫（美國(guó)，加利福尼亞州圣克拉拉）生物分析儀2100進(jìn)行驗(yàn)證。最終使用HiSeq2000（Illumina）對(duì)文庫(kù)進(jìn)行深度測(cè)序。每個(gè)處理的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。本研究中使用的原始序列數(shù)據(jù)已提交GSA（Genome Sequence Archive）數(shù)據(jù)庫(kù)[17]及中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所（BIG）生命與健康大數(shù)據(jù)中心（2019年會(huì)員），注冊(cè)號(hào)為CRA001345，可在http://bigd.big.ac.cn/gsa上公開(kāi)訪問(wèn)。

1.3 miRNA的鑒定和基因表達(dá)譜分析

對(duì)原始數(shù)據(jù)去接頭[19]、過(guò)濾低質(zhì)量讀長(zhǎng)序列之后，將miRNA讀長(zhǎng)檢測(cè)序列與青稞參考基因組進(jìn)行比對(duì)[18]，使用miRDeep2（https://github.com/rajewskylab/mirdeep2）軟件鑒定青稞miRNA。在所有樣品中，miRNA讀數(shù)均大于66，以此識(shí)別候選miRNA。使用BLAST將這些潛在的miRNA與Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)[20]（版本：10.1），鑒定其他ncRNA（非編碼RNA）。為了鑒定已知的miRNA，使用BLAST將潛在的miRNA標(biāo)簽與miRBase中存在的成熟miRNA進(jìn)行比對(duì)[21]，不超過(guò)2個(gè)錯(cuò)配的miRNA被認(rèn)為是已知的miRNA。DESeq2 R包[22]用于鑒定差異表達(dá)的基因。顯著性變化的閾值為fold-change(倍數(shù)變化)>2，校正后的P值<0.05。

1.4 靶基因預(yù)測(cè)和靶功能富集分析

使用psRobot（v1.2,http://omicslab.genetics.ac.cn/psRobot/downloads.php）軟件在默認(rèn)參數(shù)下預(yù)測(cè)miRNA的靶基因。使用Cytoscape 3.6.1可視化miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[23]。使用Top GO R包[24]對(duì)顯著差異表達(dá)的miRNA的靶基因進(jìn)行功能分類(lèi)和富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞miRNA的鑒定

對(duì)于所有66個(gè)miRNA文庫(kù)，在將低質(zhì)量讀長(zhǎng)序列和接頭序列進(jìn)行過(guò)濾后，共剩余897 112 430條凈讀長(zhǎng)序列（clean reads），每個(gè)文庫(kù)的讀長(zhǎng)總數(shù)范圍為9 908 031～20 151 566條，唯一讀長(zhǎng)數(shù)目范圍為1 059 453～5 097 449條。最豐富的miRNA的長(zhǎng)度范圍為20～24個(gè)核苷酸，最常見(jiàn)的miRNA的長(zhǎng)度為21和24個(gè)核苷酸。讀長(zhǎng)比對(duì)率為58.01%～92.76%。在66個(gè)樣品中，共13 757個(gè)潛在的miRNA有表達(dá)。在本分析中，與其他非編碼RNA類(lèi)型匹配的miRNA標(biāo)簽被去除，但是沒(méi)有潛在的miRNA標(biāo)簽映射到Rfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http://rfam.xfam.org/）。分布在單個(gè)染色體上的miRNA數(shù)量在1 513（第4染色體）與1 996（第2染色體）之間，并且這些miRNA大致均勻地分布在整個(gè)染色體上。在本研究所有文庫(kù)中，miRNA的相對(duì)表達(dá)水平分布為66～7 821 211個(gè)讀長(zhǎng)。

2.2 已知和新miRNA的BLAST比對(duì)

使用BLAST將潛在的miRNA序列與miRBase中公開(kāi)的miRNA序列進(jìn)行比較[13]，鑒定已知的miRNA，結(jié)果顯示：有225個(gè)miRNA在miRBase中是保守的，主要分布在hvu-miR5049和hvu-miR1436家族；其余的13 532個(gè)miRNA是推定的新型miRNA。長(zhǎng)度在20～24個(gè)核苷酸的miRNA數(shù)量為11 759，其中28.3%長(zhǎng)度為21個(gè)核苷酸，53.7%長(zhǎng)度為24個(gè)核苷酸。miRNA前體的長(zhǎng)度為34～113個(gè)核苷酸，平均長(zhǎng)度為72個(gè)核苷酸。

計(jì)算所有miRNA的核苷酸組成，核苷酸中腺嘌呤（A）為23.5%，尿嘧啶（U）為26.4%，胞嘧啶（C）為18.6%，鳥(niǎo)嘌呤（G）為31.5%（圖1）。

2.3 鹽堿處理和對(duì)照青稞的miRNA表達(dá)模式

為了鑒定在鹽堿脅迫下差異表達(dá)的miRNA，基于歸一化表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)比較，對(duì)差異表達(dá)模式進(jìn)行了分析。我們通過(guò)比較鹽堿處理和對(duì)照樣品分析了0226在5個(gè)應(yīng)激階段（2、8、24、48和72 h）中的miRNA表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)上調(diào)和下調(diào)的顯著差異表達(dá)的miRNA在8和48 h階段增加，在24 h階段減少（圖2-A）。對(duì)于0119發(fā)現(xiàn)了相同的表達(dá)模式（圖2-B）。

比較了0119和0226品種中差異表達(dá)的miRNA（圖3），大多數(shù)miRNA在0119或0226品種中被特異性上調(diào)或下調(diào)。

2.4 青稞miRNA的靶基因功能預(yù)測(cè)

miRNA的功能通常是靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，由于與特定mRNA的序列互補(bǔ)性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯抑制或裂解[25]，總共363個(gè)差異表達(dá)的miRNA具有潛在的靶標(biāo)候選物，映射到了Swiss Prot數(shù)據(jù)庫(kù)的靶標(biāo)基因。miRNA預(yù)測(cè)的靶標(biāo)數(shù)量差異很大，范圍為1～2 107，總共為363個(gè)miRNA確定了7 608個(gè)唯一的目標(biāo)候選物。大多數(shù)miRNA（224個(gè)）具有多個(gè)靶基因（2～100個(gè)），83個(gè)miRNA僅具有1個(gè)靶基因，56個(gè)miRNA每個(gè)具有100多個(gè)靶基因。miRNA及其靶基因的一些例子顯示了相反的表達(dá)模式。該靶標(biāo)預(yù)測(cè)分析表明，已鑒定的靶標(biāo)基因調(diào)控了廣泛的生物學(xué)過(guò)程。所有這些目標(biāo)基因均按照基因本體（GO）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能分類(lèi)（表1）。在細(xì)胞成分（cellular component）類(lèi)別中，前10個(gè)GO類(lèi)別顯示大 多 數(shù) 目 標(biāo) 基 因 與 膜 相 關(guān)（GO：0016020，GO：0016021，GO：0031224，GO：0044425和GO：0012505等）。在生物過(guò)程（biological process）類(lèi)別中，最富集的條目與運(yùn)輸相關(guān)（GO：0044765，GO：0006811，GO：0006810，GO：0006812，GO：0055085和GO：0030001）。在分子功能（molecular function）類(lèi)別中，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性（GO：0005215）、離子結(jié)合（GO：0005507和GO：0030001）、過(guò)氧化物酶活性（GO：0004601）、氧化還原酶活性（GO：0016684）和抗氧化活性（GO：0016209）是顯著富集。分析發(fā)現(xiàn)，與“膜”相關(guān)的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，Thb-miRn724a-3p、Thb-miRn724-1-5p和Thb-miRn1158-3p位于網(wǎng)絡(luò)的中心。KEGG通路富集分析表明，最富集的6個(gè)通路展示在表2中，其中“植物-病原體相互作用”和“植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”分別富集到248和149個(gè)靶向基因。此外，靶基因GO富集分析顯示，目標(biāo)基因在2 h階段顯著富集了氧化還原酶活性（GO：0016682，GO：0016491和GO：0016679）和陽(yáng)離子結(jié)合（GO：0043169）。24 h時(shí)富集的GO條目是ATP酶活性（GO：0042623，GO：0042626和GO：0043492）和水解酶活性（GO：0016820）。在48 h的靶基因GO分析顯示出金屬簇結(jié)合（GO：0051540）、核苷酸結(jié)合（GO：0000166）和核苷三磷酸酶活性（GO：0017111）富集，而在72 h條件下的靶基因富集氧化還原酶活性（GO：0016682，GO：0016679和GO：0016491）和銅離子結(jié)合（GO：0005507）。

表1 所有鹽堿反應(yīng)性miRNA靶基因的GO功能分類(lèi)

表2 所有鹽堿反應(yīng)性miRNA靶基因的KEGG通路富集的類(lèi)別

3 討論與結(jié)論

已有研究報(bào)道了對(duì)鹽堿條件的兩階段生長(zhǎng)反應(yīng)[26-27]，在玉米和小麥品種中已經(jīng)證實(shí)了這種兩階段生長(zhǎng)反應(yīng)[28-30]。第一階段主要的作用是水分脅迫或滲透作用，由于鹽的積累，第二階段的主要作用是離子性的。在本研究中，顯著差異表達(dá)的miRNA數(shù)量在24 h下降。這種現(xiàn)象表明第一階段可能發(fā)生在青稞用200 mmol/L Na+培養(yǎng)液處理的前24 h。GO富集分析表明，目標(biāo)基因在2 h階段主要為氧化還原酶活性相關(guān)的蛋白，隨后在24、48及72 h，ATP酶活性、水解酶活性、核苷酸結(jié)合及銅離子結(jié)合相關(guān)的蛋白呈現(xiàn)顯著的表達(dá)。這些結(jié)果與先前研究報(bào)道的生理現(xiàn)象[31-33]一致，這是對(duì)植物鹽堿脅迫的反應(yīng)。

本研究鑒定出的大部分miRNA是物種特異性的。在擬南芥[10]、玉米[11]和水稻[34]中，已鑒定出許多與植物對(duì)鹽脅迫反應(yīng)相關(guān)的miRNA。我們鑒定了13 757個(gè)miRNA，其中只有225個(gè)在大麥中保守，2 227個(gè)對(duì)鹽堿脅迫有響應(yīng)。這些miRNA可以與靶mRNA的非翻譯區(qū)（UTR）或編碼序列（CDS）互補(bǔ)結(jié)合，從而降低mRNA的表達(dá)水平[1，35]。盡管表達(dá)的miRNA可以負(fù)調(diào)控其靶標(biāo)mRNA，但由于調(diào)控關(guān)系的復(fù)雜性，其靶標(biāo)可能表現(xiàn)出多樣化的表達(dá)模式。根據(jù)miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的靶標(biāo)基因的GO注釋?zhuān)覀兺茢唷澳ぁ钡男纬膳c鹽堿脅迫應(yīng)答有著密切的關(guān)系。在以前的研究中，為預(yù)測(cè)鹽堿脅迫相關(guān)的靶標(biāo)，發(fā)現(xiàn)許多靶標(biāo)是SPL（類(lèi)表面活性物質(zhì)B蛋白）、MYB（myb域蛋白）、ARF（生長(zhǎng)素應(yīng)答因子）、AP2（花瓣分生組織發(fā)育蛋白APETALA2）、NAC（NAC結(jié)構(gòu)域蛋白）和NF-Y（核轉(zhuǎn)錄因子Y）。NAC在鹽度、寒冷、ABA和干旱脅迫下受到廣泛調(diào)節(jié)[36-38]。在這里，鹽和干旱脅迫廣泛調(diào)節(jié)了一個(gè)NF-YA（核轉(zhuǎn)錄因子Y亞基A）靶標(biāo)[39,34]；確定了一組介導(dǎo)ARF調(diào)節(jié)的miRNA，ARF可能在植物對(duì)各種非生物脅迫（例如鹽，冷和干旱脅迫）的反應(yīng)中起重要作用[40-45]；還鑒定了其他基因，包括調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的SPL、MYB和AP2；認(rèn)為許多編碼重要酶和蛋白質(zhì)的靶基因在鹽脅迫反應(yīng)中也起著重要作用。我們還發(fā)現(xiàn)，miRNA交叉調(diào)控了幾個(gè)靶基因，且單個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因。靈活的調(diào)控模式表明，這些相互作用可以調(diào)控特定發(fā)育階段和生活環(huán)境中的特定靶標(biāo)。該研究可能有助于其他作物及植物鹽堿逆境應(yīng)答研究方法的完善，以提高農(nóng)作物適應(yīng)各種環(huán)境條件的能力。