藺 林 戴 飛 任國強(qiáng) 魏瑾瑾 陳 崢 湯欣玥

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院北院耳鼻咽喉頭頸外科，上海 201907)

目前全世界慢性鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)發(fā)病率約為1%～9%，且逐年增長[1]。我國CRS發(fā)病率約為8%，嚴(yán)重威脅公眾健康。CRS的主要癥狀為鼻塞、流黏涕或黏膿涕，是病程超過12周的鼻腔、鼻竇黏膜慢性炎癥性疾病[1，2]。按照外表型分類，CRS可分為慢性鼻竇炎不伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP)和慢性鼻竇炎伴有鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)[3]。按照細(xì)胞內(nèi)表型分類，CRS可分為嗜酸性粒細(xì)胞型和非嗜酸性粒細(xì)胞型(嗜中性粒細(xì)胞型)[4]。黏液的過度分泌是CRS的特征之一，但具體機(jī)制尚不明確[5]。本文旨在探討人嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(human neutrophils elastase，HNE)體外干預(yù)對嗜中性粒細(xì)胞型鼻息肉(neutrophilic nasal polyps，NNP)上皮中杯狀細(xì)胞(goblet cells，GC)合成和黏蛋白(mucin，MUC)5AC釋放的影響。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 正常鼻黏膜組織來源于12 例因鼻塞而行鼻中隔矯正和下鼻甲成形手術(shù)患者的下鼻甲，男女各半，年齡19～61歲，平均年齡42.92歲；NNP組織來源于18例(10男8女)就診于我院耳鼻咽喉頭頸外科并行鼻內(nèi)鏡手術(shù)的CRSwNP患者，年齡18～66歲，平均年齡41.56歲。CRSwNP診斷標(biāo)準(zhǔn)參照EPOS2012和中國慢性鼻竇炎診斷和治療指南(2018)[1,3]。所有患者術(shù)前至少1個月未服用禁用藥物，都接受包括屋塵螨和其他12種常見吸入性過敏原在內(nèi)的皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)以評估其特應(yīng)性狀態(tài)，陽性標(biāo)準(zhǔn)為皮膚表面風(fēng)團(tuán)面積>7 mm2(直徑>3 mm)。排除哮喘的依據(jù)包括病史、體格檢查和肺功能測試。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者知情同意。

1.1.2試劑與儀器 嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(eosinophilcation protein，ECP)、髄過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)單克隆抗體(MBS2085906或MBS8559315)、HNE(MBS568799)、MUC5AC ELISA試劑盒(MBS1606592)均購自美國MyBioSource公司；RT-PCR試劑盒(RR066A)購自日本TaKaRa公司；徠卡激光掃描共聚焦顯微鏡(TCS SP5)購自德國Leica公司。

1.2方法

1.2.1分組 標(biāo)本分為2組：1組用于免疫熒光染色或HE染色，另1組用于體外培養(yǎng)及相應(yīng)的體外研究。

1.2.2免疫熒光染色 將組織切片與ECP或MPO單克隆抗體室溫下孵育過夜，PBS洗3次，每次5 min，與結(jié)合異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyante，F(xiàn)ITC)的二抗室溫黑暗孵育1 h，用含有0.2% Triton X-100的PBS(PBS-T)洗滌2次，以濃度為10 mg/ml的DAPI在室溫下細(xì)胞核染色5 min，PBS-T及PBS清洗，防熒光淬滅劑封片，顯微鏡拍照，LCS Lite軟件分析圖片。

1.2.3HE染色 組織切片在二甲苯中脫蠟10 min，梯度濃度乙醇(100%、95%、85%和70%)浸泡，蘇木精染色10 min，沖洗，伊紅染色5 min，梯度濃度乙醇(70%、85%、95%和100%)脫水，二甲苯透明10 min，中性樹膠封片。GC細(xì)胞計(jì)數(shù)根據(jù)每高倍視野(×400)下細(xì)胞數(shù)目的平均值(3次)，由2位對本項(xiàng)目完全不知情的研究者進(jìn)行評估。

1.2.4器官培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)[6]將正常鼻黏膜組織和NNP組織進(jìn)行體外器官培養(yǎng)，無菌條件下分割為2～3 mm3組織塊，用含有5 μg/ml兩性霉素B和300 μg/ml 青霉素G的PBS洗3次，以含有10%小牛血清和20 μg/ml慶大霉素的98%DMEM再清洗，加入600 μg/ml HNE孵育1 h，將組織塊放于1×1 cm 大小的濕明膠海綿，黏膜面或息肉面朝上，明膠海綿放于含有3 ml培養(yǎng)液的6孔板，黏膜或息肉高于液面，37℃、5%CO2孵育，連續(xù)轉(zhuǎn)動24 h(15 r/min)，收集組織塊進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)(圖1)。

1.2.5ELISA檢測MUC5AC蛋白水平 將正常鼻黏膜組織和NNP組織塊再次分割，RIPA裂解液分解，MUC5AC ELISA試劑盒檢測組織MUC5AC蛋白含量，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.2.6RT-PCR檢測正常鼻黏膜組織和NNP組織中的MUC5AC mRNA MUC5AC引物由上海捷蘭生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)，F(xiàn)：5′-TGATCATCCAGCAGCAG-GGCT-3′，R：5′-CCGAGCTCAGAGGACATATGGG-3′；內(nèi)參β-actin F：5′-CACTCTTCCAGCCTTCCTTC-3′，R：5′-GTACAGGTCTTTGCGGATGT-3′，按照RT-PCR試劑盒說明書檢測，2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 GraphPad Prism6軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗(yàn)法進(jìn)行分析。如果組間Kruskal-Wallis檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則用Mann-Whitney檢驗(yàn)進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)，以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1臨床病理分析 本研究收集的NNP病例中男性多于女性，且均為非特應(yīng)性體質(zhì)(至少對包括屋塵螨在內(nèi)的13項(xiàng)常見過敏原進(jìn)行檢測)，說明NNP組織以Ⅰ 型炎癥反應(yīng)為主。近期未局部應(yīng)用或口服激素、抗組胺藥或抗菌藥，說明該息肉組織受外界影響較小，可以反映自然狀態(tài)下的NNP發(fā)病特點(diǎn)，見表1。

2.2檢測NNP中嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞浸潤情況 所有正常鼻黏膜組織標(biāo)本中幾乎未出現(xiàn)炎癥細(xì)胞，所有NNP標(biāo)本中出現(xiàn)2種炎癥細(xì)胞，但嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量均 <10個/高倍視野，而中性粒細(xì)胞數(shù)均 >10個/高倍視野，因此本研究中息肉組織均屬于NNP，見圖1。

2.3正常鼻黏膜組織和NNP組織干預(yù)前后GC數(shù)目和炎癥細(xì)胞浸潤情況 NNP中GC計(jì)數(shù)多于正常黏膜組織(P<0.000 1)，HNE作用后，GC顯著增生或由纖毛上皮化生，GC數(shù)目顯著高于NNP組織(P<0.000 1)，NNP組織在HNE干預(yù)前后炎癥細(xì)胞數(shù)均多于正常組織，見圖2。

2.4HNE對NNP中GC合成和釋放MUC5AC的影響 NNP組MUC5AC蛋白及mRNA含量顯著高于正常鼻黏膜組(P<0.000 1)，經(jīng)HNE體外干預(yù)后，MUC5AC蛋白及mRNA表達(dá)進(jìn)一步升高，即HNE干預(yù)組MUCAC蛋白及mRNA水平顯著高于NNP組(P<0.000 1)，見圖3。

表1 臨床病理資料

圖1 正常鼻黏膜和NP組織的免疫熒光染色(×400)Fig.1 Immuofluorescent staining of normal nasal mucosa and NP tissues(×400)Note:A，B，C，D.Normal nasal mucosa tissues;E，F(xiàn)，G，H.NP tissues.

圖2 正常鼻黏膜和NP組織HE染色(×400)Fig.2 HE staining of normal nasal mucosa and NP tissues(×400)Note:A.Normal nasal mucosa tissue;B.Nasal polyp tissue;C.Nasal polyp tissue after treatment of HNE；****.P<0.000 1.

圖3 正常鼻黏膜、NP組織、HNE干預(yù)后NP組織中MUC5AC水平比較Fig.3 Comparisons of MUC5AC levels among normal nasal mucosa，NP and NP tissues after treatment of HNENote:****.P<0.000 1.

3 討論

黏蛋白是上呼吸道黏液性分泌物的主要成分，與水、離子、抗菌物質(zhì)、抗氧化分子和抑制性蛋白酶類等及上皮纖毛共同組成黏液纖毛清除系統(tǒng)，是抵抗吸入性抗原物質(zhì)的第一道防線[7]。但黏液分泌亢進(jìn)會導(dǎo)致CRS患者發(fā)病時黏涕或黏膿涕大量外溢，或經(jīng)前鼻孔流出或形成鼻后滴漏，影響患者生活質(zhì)量[1]。黏蛋白包括分泌性黏蛋白及結(jié)構(gòu)性黏蛋白，前者主要包括MUC5AC和MUC5B，MUC5AC主要由GC合成和釋放，MUC5B主要由黏膜下腺體產(chǎn)生和分泌，對呼吸道黏液纖毛清除功能起重要作用，后者主要包括跨膜糖蛋白，位于呼吸道上皮表面，黏附吸入性抗原，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，參與固有免疫、細(xì)胞分化和增殖[8,9]。黏蛋白表達(dá)和功能異常會導(dǎo)致黏液清除系統(tǒng)失效、固有免疫障礙和氣道重構(gòu)等，最終誘發(fā)上下呼吸道疾病，如囊性纖維化、哮喘、慢性阻塞性肺病，甚至惡性腫瘤等[10,11]。黏蛋白的表達(dá)特點(diǎn)與CRS發(fā)病機(jī)制的關(guān)系鮮有報(bào)道，且尚無證據(jù)表明黏蛋白的異常表達(dá)與NP的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。研究表明，與CRSsNP相比，MUC5AC或MUC5B在CRSwNP患者的息肉組織中表達(dá)提高，但具體機(jī)制尚不明確，可能與局部的轉(zhuǎn)錄因子或細(xì)胞因子濃度上調(diào)有關(guān)[12-15]。因此，本研究探討HNE體外干預(yù)對NNP上皮中GC合成和釋放MUC5AC的影響。

研究證實(shí)，亞裔CRSwNP患者的NP組織中嗜酸性粒細(xì)胞無明顯增多，伴隨著相應(yīng)Ⅱ型細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)減少，同時出現(xiàn)Ⅰ型偏向的炎癥反應(yīng)特點(diǎn)，并伴隨嗜中性粒細(xì)胞浸潤增多[16]。本研究納入的NP患者經(jīng)免疫熒光染色鑒定均為NNP類型。將正常鼻黏膜與NP組織在體外進(jìn)行器官培養(yǎng)，將組織放置于空氣和培養(yǎng)液交界處，模擬鼻腔和鼻竇生理病理環(huán)境下黏膜和息肉組織的存活狀態(tài)，可較好地反映組織真實(shí)生理病理情況[6]。

本研究表明，NNP中GC多于正常黏膜組織，說明NP組織上皮中GC出現(xiàn)增生或由纖毛上皮化生[17]。HNE干預(yù)后，GC進(jìn)一步出現(xiàn)增生或化生，顯微鏡下計(jì)數(shù)結(jié)果表明，NNP組織中GC計(jì)數(shù)顯著多于正常黏膜，HNE的作用促進(jìn)GC數(shù)目繼續(xù)增多，說明該蛋白酶可直接或間接作用于黏膜上皮，導(dǎo)致GC增殖，但機(jī)制有待進(jìn)一步研究。NNP組織在HNE干預(yù)前后炎癥細(xì)胞均多于正常組織，由于計(jì)數(shù)誤差和NP組織中炎癥狀態(tài)情況，本研究未對上述組織中的炎癥細(xì)胞進(jìn)一步定量分析。為進(jìn)一步確定體外HNE干預(yù)對NNP中GC合成和釋放MUC5AC的影響，本研究將對象分成正常鼻黏膜組、NNP組和HNE干預(yù)組，并用ELISA和實(shí)時定量RT-PCR法對各組培養(yǎng)基中MUC5AC蛋白及其mRNA的濃度進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，NNP組中MUC5AC蛋白及mRNA含量顯著高于正常鼻黏膜組，說明息肉發(fā)生、發(fā)展過程中，黏蛋白MUC5AC在GC中的合成和釋放均有增加，經(jīng)HNE干預(yù)后該蛋白及mRNA表達(dá)進(jìn)一步升高，說明NNP發(fā)病機(jī)制中，嗜中性粒細(xì)胞釋放的HNE可促進(jìn)上皮中GC的增生或化生，上調(diào)GC中MUC5AC合成和分泌。本研究側(cè)面證實(shí)了嗜中性粒細(xì)胞在NP病理生理機(jī)制中可能的作用機(jī)制。