丁婷婷 張 紅 馮繼紅 馬 虎

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院腫瘤科，遵義 563003)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界范圍內(nèi)最常見的消化道惡性腫瘤。主要發(fā)生于直腸和乙狀結(jié)腸交界處，在40～50歲人群發(fā)病風(fēng)險最高，男性的發(fā)病率是女性的2～3倍[1]。CRC具有侵襲性和轉(zhuǎn)移性，伴有療效差、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差及高發(fā)病率等特點(diǎn)，其發(fā)病率和死亡率分別排在所有惡性腫瘤的第三和第四[2，3]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活方式的變化，CRC的發(fā)病率升高，且發(fā)病人群年輕化[4]。2017年Siegel等[5]發(fā)現(xiàn)，盡管年輕群體中CRC患者僅占癌癥患者總數(shù)的一小部分，但在該群體中CRC的發(fā)生率正在以驚人的速度上升。其隱匿的臨床表現(xiàn)和預(yù)后不良的特點(diǎn)，已經(jīng)對人類健康造成重大負(fù)擔(dān)。

miR-581是一類新近發(fā)現(xiàn)的大小約85 bp的miRNA分子[6]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-581在CRC組織中低表達(dá)，且在細(xì)胞水平檢測出其可抑制CRC細(xì)胞的侵襲和遷移并驗(yàn)證miR-581靶向調(diào)控PRDX1[7]。本研究通過上調(diào)CRC細(xì)胞株SW620中miR-581表達(dá)，利用帶有熒光素酶標(biāo)記的病毒感染CRC細(xì)胞株SW620(記為miR-581-NC-Luc、miR-581-UP-Luc)，經(jīng)尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)，建立裸鼠CRC轉(zhuǎn)移模型，通過體內(nèi)熒光成像動態(tài)觀察miR-581對CRC生長及轉(zhuǎn)移能力的影響。體外細(xì)胞水平驗(yàn)證結(jié)合體內(nèi)組織水平驗(yàn)證綜合評估m(xù)iR-581在體內(nèi)外對CRC細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響，為深入研究抑制CRC腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制并找到抑制手段提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞 4周齡左右的雌性BALB/c SPF級裸小鼠，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號碼：SCXK(湘)2014-0011；SW620細(xì)胞株購自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。

1.1.2試劑和儀器 L-15 培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司；熒光素酶慢病毒誘導(dǎo)表達(dá)載體購自上海吉凱基因；Lumina LT小動物活體成像系統(tǒng)購自美國Perkin Elmer公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 結(jié)直腸癌細(xì)胞株 SW620培養(yǎng)于含10%FBS和1%PEST。L-15培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為 37℃、5%CO2，每 2～3 d 換液1次，當(dāng)細(xì)胞數(shù)達(dá)長滿培養(yǎng)瓶底部時，收集細(xì)胞。

1.2.2制備miR-581-NC和miR-581-UP穩(wěn)轉(zhuǎn)株 熒光素酶標(biāo)記的慢病毒感染處于對數(shù)生長期的SW620細(xì)胞，胰酶消化，完全培養(yǎng)基制成5×104個/ml細(xì)胞懸液，并以2.5×106個/孔細(xì)胞接種于6孔板、繼續(xù)培養(yǎng)保證感染時鋪板量達(dá)到15～30%。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，12 h更換感染培養(yǎng)基，根據(jù)病毒MOI值加入1 μl病毒感染。觀察感染后細(xì)胞狀態(tài)及感染效率。若下游為細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，需保證感染效率達(dá)到 80%左右；若為篩靶實(shí)驗(yàn)，則感染效率需達(dá)到 90%以上。

1.2.3尾靜脈注射轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建 準(zhǔn)備好腫瘤細(xì)胞后(2×107/ml)，一次性無菌注射器吸取細(xì)胞，緩慢注射至裸鼠尾靜脈，100 μl/只?；铙w成像儀下觀察細(xì)胞接種情況：10 μl/g劑量腹腔注射D-Luciferin(15 mg/ml)，15 min后，按10 μl/g劑量腹腔注射 0.7%戊巴比妥鈉麻醉動物，待動物麻醉，將其置于活體成像儀下成像，觀察熒光，保存數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)組及對照組各5只裸小鼠，兩組裸小鼠從尾靜脈注射后第一周開始活體成像動態(tài)觀察，之后每周觀察1次。連續(xù)觀察5周結(jié)束實(shí)驗(yàn)，結(jié)束前對小鼠進(jìn)行最后1次活體成像，方法同上。

1.2.4取轉(zhuǎn)移肺組織做HE染色及組織免疫熒光 成像結(jié)束后，對實(shí)驗(yàn)動物注射過量 2%戊巴比妥鈉(0.5 ml)安樂致死，待其完全昏迷再進(jìn)行頸椎脫臼確認(rèn)死亡。取出其肺、肝臟及其他器官組織，熒光成像觀察其器官組織是否有出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，并進(jìn)行熒光定量分析。將取出的肝、肺等器官，置于多聚甲醛固定常溫或-80℃冷凍后液氮保存，為后續(xù)HE染色及免疫熒光等實(shí)驗(yàn)作準(zhǔn)備。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，行方差齊性分析檢驗(yàn)，F(xiàn)≥0.05，則按等方差雙樣本檢驗(yàn)得到P值，F(xiàn)<0.05，則按異方差雙樣本檢驗(yàn)得到P值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1miR-581-Luc轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞后轉(zhuǎn)染效率檢測 兩組均成功轉(zhuǎn)入病毒，PRDX1的熒光表達(dá)強(qiáng)表明SW620-miR-581-UP組的表達(dá)強(qiáng)度較SW620-NC組減弱。見圖1。

2.2miR-581對SW620中PRDX1在mRNA水平表達(dá)的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示，SW620-miR-581-UP組PRDX1表達(dá)水平顯著低于SW620-NC組(P<0.05，圖2)。

2.3尾靜脈注射轉(zhuǎn)移模型的建立 結(jié)果表明，兩組細(xì)胞接種后第2周即可通過活體成像系統(tǒng)在胸部檢測到腫瘤細(xì)胞的發(fā)光信號，熒光信號隨接種時間增長逐漸增強(qiáng)，在第5周達(dá)到最強(qiáng)(圖3)。區(qū)域內(nèi)熒光表達(dá)總量可以間接反映攜帶熒光標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量或腫瘤體積。

2.4轉(zhuǎn)移結(jié)果統(tǒng)計 轉(zhuǎn)移結(jié)果統(tǒng)計為：SW620-NC組尾靜脈接種5只，肺轉(zhuǎn)移4只，轉(zhuǎn)移率80%；SW620-miR-581-UP組尾靜脈接種5只，肺轉(zhuǎn)移3只，轉(zhuǎn)移率60%。SW620-NC組及miR-581-UP組裸小鼠均未發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移灶。分析各組裸鼠的區(qū)域內(nèi)熒光表達(dá)量，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組各裸鼠平均熒光表達(dá)量較NC組低(P<0.05)，測定值差異為20%～50%，判斷為陽性結(jié)果，見圖4。

2.5轉(zhuǎn)移裸小鼠肺組織的HE染色 鏡下可見腫瘤細(xì)胞排列成巢狀或團(tuán)索狀，腫瘤細(xì)胞大小各異，形態(tài)不規(guī)則，胞漿豐富，細(xì)胞核大而深染，核分裂象多見(圖5)。

圖1 細(xì)胞熒光間接檢測SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-581的表達(dá)Fig.1 Indirect detection of expression of miR-581 after transfection of SW620 cells by cell fluorescence

圖2 qRT-PCR檢測SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染后PRDX1表達(dá)Fig.2 qRT-PCR detection of PRDX1 expression after SW620 cell transfectionNote:Compared with SW620-miR-581-UP，***.P<0.05.

圖3 活體熒光成像動態(tài)監(jiān)測原位移植SW620-Luc細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)表達(dá)情況Fig.3 Dynamic monitoring of in vivo fluorescence imaging of SW620-Luc cells in nude mice

圖4 實(shí)驗(yàn)組及對照組裸鼠轉(zhuǎn)移情況統(tǒng)計Fig.4 Statistics of metastasis of nude mice in experimen-tal group and control groupNote:A.Fluorescence expression in lung area of nude mice；B.Comparative analysis of fluorescence expression in average area of experimental group and control group.

圖5 光鏡下觀察裸鼠肺組織CRC轉(zhuǎn)移灶Fig.5 Observation of metastasis of CRC in lung tissues of nude mice under light microscope

圖6 轉(zhuǎn)移裸小鼠肺組織標(biāo)本免疫熒光檢測PRDX1的陽性率Fig.6 Immunofluorescence detection of PRDX1 positive rate in lung tissue of transferred nude mice

2.6轉(zhuǎn)移小裸鼠冰凍肺組織切片免疫熒光染色 SW620-NC對照組PRDX1表達(dá)量高于SW620-miR-581-UP實(shí)驗(yàn)組，從組織水平證明miR-581上調(diào)可降低PRDX1表達(dá)，與細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致(圖6)。

3 討論

活體成像技術(shù)已被用于多種腫瘤動物模型中原發(fā)性腫瘤生長及轉(zhuǎn)移情況的檢測[8]。該技術(shù)可隨時間推移對同一組動物中的腫瘤負(fù)荷進(jìn)行非侵入性動態(tài)觀察和實(shí)時評估[9]。熒光素酶基因可以穩(wěn)定地整合至靶細(xì)胞染色體，且不會隨細(xì)胞分裂而丟失。熒光素酶轉(zhuǎn)染的細(xì)胞幾乎可以監(jiān)測動物體內(nèi)的任何位置，僅有少數(shù)細(xì)胞足以產(chǎn)生可通過MRI或CT掃描檢測不到的信號[10-12]。此外，熒光活體成像可定量標(biāo)記體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的存活數(shù)量，從而在同一實(shí)驗(yàn)或多個實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行比較。非侵入性地跟蹤體內(nèi)腫瘤細(xì)胞并實(shí)時觀察其生長可以更好地理解癌癥發(fā)展機(jī)制及干預(yù)手段的療效[13]?；铙w成像技術(shù)在腫瘤干預(yù)的實(shí)時觀察研究中具有重大意義[14]。

miRNAs在腫瘤中多為異常表達(dá)，近年研究提示miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，其可靶向作用于多種基因參與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)過程[15,16]。過氧化還原酶1(PRDX1)又稱為增殖相關(guān)蛋白，屬于過氧化還原酶超家族主要成員，定位于細(xì)胞質(zhì)，與細(xì)胞的增殖和分化相關(guān)，在乳腺癌、肺癌及CRC等多種實(shí)體瘤組織中高表達(dá)[17]。課題組前期生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PRDX1的3′UTR區(qū)有miR-581結(jié)合位點(diǎn)，并在細(xì)胞水平上驗(yàn)證得出miR-581靶向負(fù)調(diào)控PRDX1。但腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，且miRNA調(diào)控的基因數(shù)目眾多，可調(diào)控很多靶點(diǎn)，在不同的腫瘤中可能發(fā)揮不同的作用[18-20]。

本研究利用慢病毒包被含有熒光素酶基因的質(zhì)粒，通過慢病毒的感染將熒光素酶基因轉(zhuǎn)染至CRC SW620細(xì)胞，并設(shè)置分組為miR-581-NC組和miR-581-UP組。通過免疫熒光檢測PRDX1表達(dá)間接檢測miR-581的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于對照組，miR-581上調(diào)組PRDX1熒光表達(dá)相對較弱，表明miR-581表達(dá)上調(diào)，病毒轉(zhuǎn)染成功，經(jīng)篩選獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株，建立裸鼠CRC皮下異位移植瘤模型。6周后統(tǒng)計得出結(jié)果為：相較于miR-581-NC組，miR-581-UP組的裸鼠體質(zhì)量無變化(P>0.05)；miR-581-NC組尾靜脈接種5只，肺轉(zhuǎn)移4只，轉(zhuǎn)移率80%；miR-581-UP組尾靜脈接種5只，肺轉(zhuǎn)移3只，轉(zhuǎn)移率60%。通過總轉(zhuǎn)移率、轉(zhuǎn)移灶個數(shù)、轉(zhuǎn)移區(qū)域內(nèi)熒光表達(dá)量等多方面分析初步得出，相對于miR-581-NC對照組，miR-581-UP實(shí)驗(yàn)組SW620在體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力有所下降；HE染色可以清晰看到核大深染的癌巢細(xì)胞團(tuán)。結(jié)合課題組前期體外試驗(yàn)結(jié)果得出，miR-581促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖，抑制其侵襲和轉(zhuǎn)移，與體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果趨勢一致，即miR-581過表達(dá)抑制CRC的體內(nèi)外的轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，從動物水平出發(fā)利用熒光活體成像闡述miR-581在CRC轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的重要功能。該技術(shù)在結(jié)直腸動物模型的活體成像過程中具有直觀性、連續(xù)性及敏感性等特點(diǎn)，與組織離體鏡下觀察相結(jié)合，提高了檢測的準(zhǔn)確性及實(shí)用性，對今后CRC的早期診斷、早期治療及抗癌藥物療效評估有重要意義。