李 林 魏旭靜 代麗麗 路素雙 劉 晶

(河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，石家莊 050000)

子宮內(nèi)膜癌是一種原發(fā)于子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤，其發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中位于首位[1]。結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(colon cancer-associated transcriptome 1,CCAT1)是結(jié)直腸癌組織中新近發(fā)現(xiàn)的一種異常高表達的長鏈非編碼RNA(LncRNA)，相關(guān)研究表明：LncRNA CCAT1與卵巢癌、肝癌和胃癌等多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)[2-4]。CCAT1通過內(nèi)源競爭等機制與微小RNA或蛋白相互作用，參與調(diào)控機體生理病理過程，其在腫瘤組織中表達水平升高，會促進腫瘤細胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移等作用[5]。目前對早期子宮內(nèi)膜癌的治療以手術(shù)治療為主，晚期子宮內(nèi)膜癌的治療以化療為主，但化療容易產(chǎn)生惡心嘔吐、免疫功能紊亂、肝腎功能損傷等方面的毒副作用[6]。雷公藤甲素是衛(wèi)矛科植物雷公藤中主要有效成分之一，具有免疫抑制、抗炎等藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)：雷公藤甲素對胃癌、卵巢癌和宮頸癌等具有一定的抑制作用[7-9]。目前尚未發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素對子宮內(nèi)膜癌抑制作用的文獻報道，本研究通過制備子宮內(nèi)膜癌荷瘤小鼠模型，給予不同劑量雷公藤甲素干預，觀察其對小鼠移植瘤生長以及子宮內(nèi)膜癌組織中LncRNA CCAT1和caspase-3表達的影響，探討其干預作用及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 C57BL/6小鼠50只，雌性，6周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購自河北省實驗動物中心，合格證號：SYXK(冀)2018-008，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)溫度(24±4)℃，濕度(55±5)%。子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細胞株購自中國科學院上海細胞生物學研究所，培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，1.0×105U/L 青霉素和100 mg/L鏈霉素)，于37℃及5%CO2條件下培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的細胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，調(diào)整細胞密度為1.0×107個/ml。雷公藤甲素購自中科院上海藥物研究所。caspase-3單克隆抗體及免疫組織化學試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。LncRNA-CCAT1序列由廣州銳博生物科技有限公司合成。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立及分組 取對數(shù)生長期細胞，勻漿處理，調(diào)整至細胞濃度1×106個/ml。取0.2 ml 接種于小鼠右腋外側(cè)皮下，每d觀察接種部位成瘤情況，約接種6 d后，以移植瘤達到5 mm×5 mm 為成瘤標準[10]。取達標小鼠40只，隨機分為模型組、低、中和高劑量雷公藤甲素組，低、中和高劑量雷公藤甲素組分別腹腔注射25、50、100 μg/kg的雷公藤甲素，1次/d，連續(xù)給藥15 d，另取10只未造模小鼠作為對照組，腹腔注射等體積生理鹽水。

1.2.2測定瘤質(zhì)量并計算抑瘤率 各組小鼠給藥15 d后禁食不禁水12 h，處死小鼠，取瘤組織，稱重，測定抑瘤率，公式如下：抑瘤率(%)=(模型組平均瘤質(zhì)量-雷公藤甲素組平均瘤質(zhì)量)/模型組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.2.3HE染色觀察組織形態(tài) 取移植瘤組織，采用4%多聚甲醛溶液固定，不同濃度乙醇脫水，透明處理，石蠟包埋，切成厚度為4 μm的組織切片，常規(guī)HE染色，光學顯微鏡下觀察腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.4TUNEL染色計算細胞凋亡指數(shù)(apoptotic-index,AI) 取移植瘤組織石蠟切片，脫蠟，水化后按TUNEL試劑盒說明書處理，光學顯微鏡下觀察，細胞核染黃為凋亡細胞。每張切片選取6個視野，計算細胞總數(shù)和凋亡細胞數(shù)，取平均值，計算AI，公式如下：AI=(凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

1.2.5免疫組織化學法檢測子宮內(nèi)膜癌組織中caspase-3蛋白表達 取移植瘤組織石蠟切片，脫蠟，水化，加入血清封閉10 min，加入caspase-3單克隆抗體，4℃放置過夜，滴加生物素化羊抗兔IgG及SAB復合液，DAB染色、蘇木精復染，封片。以細胞呈棕褐色為蛋白表達陽性標準，每張切片選取6個視野，測定每個視野的平均吸光度值，為caspase-3蛋白表達密度。

1.2.6qPCR法檢測LncRNA-CCAT1 mRNA表達 取移植瘤組織，采用Trizol法提取組織總RNA，采用紫外分光光度計于280 nm波長下檢測總RNA濃度及純度，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，PCR擴增儀檢測LncRNA-CCAT1 mRNA表達水平。通過Primer 5.0軟件設(shè)計引物，CCAT1引物序列：上游5′-CCAATTGAACCGAGCCTTGT-3′；下游5′-TCGTGAGCG-TTTTCGCAATG-3′，長度298 bp；內(nèi)參GAPDH引物序列：上游5′-TCCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3′，下游5′-TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3′，長度176 bp。PCR擴增體系為10 μl，反應(yīng)條件：50℃，2 min；95℃，10 min；95℃，15 s；60℃，1 min，進行35個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法表示LncRNA-CCAT1 mRNA相對表達量。

2 結(jié)果

2.1雷公藤甲素對抑瘤率的影響 與模型組比較，對照組、低、中和高劑量雷公藤甲素組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，低、中和高劑量雷公藤甲素組小鼠移植瘤瘤質(zhì)量明顯減少(P<0.05)。高劑量雷公藤甲素組抑瘤率明顯高于低和中劑量雷公藤甲素組(P<0.05)。見表1。

2.2各組小鼠腫瘤組織病理學觀察 模型組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織血管豐富，腫瘤細胞大小、外形不一致，生長密集，排列不規(guī)則，細胞核形態(tài)不一致，出現(xiàn)病理性核分裂像。低、中、高劑量雷公藤甲素組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織內(nèi)血管減少，結(jié)構(gòu)破壞，松散，腫瘤細胞散在，出現(xiàn)不同程度壞死，細胞核碎裂，伴隨劑量升高組織壞死面積增大。見圖1。

2.3雷公藤甲素對子宮內(nèi)膜癌組織凋亡情況的影響 與模型組比較，低、中和高劑量雷公藤甲素組小鼠腫瘤組織凋亡細胞數(shù)均明顯增加，AI均明顯升高(P<0.05)；與低劑量雷公藤甲素組比較，中和高劑量雷公藤甲素組小鼠腫瘤組織凋亡細胞數(shù)均明顯增加，AI均明顯升高(P<0.05)；與中劑量雷公藤甲素組比較，高劑量雷公藤甲素組小鼠腫瘤組織凋亡細胞數(shù)明顯增加，AI明顯升高(P<0.05)。見圖2和表2。

2.4雷公藤甲素對子宮內(nèi)膜癌組織caspase-3蛋白表達的影響 與模型組比較，低、中和高劑量雷公藤甲素組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織中caspase-3蛋白表達均明顯上調(diào)，A值均明顯上升(P<0.05)；與低劑量雷公藤甲素組比較，中和高劑量雷公藤甲素組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織中caspase-3蛋白A值均明顯升高(P<0.05)；與中劑量雷公藤甲素組比較，高劑量雷公藤甲素組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織中caspase-3蛋白A值明顯增加(P<0.05)，其表達水平呈劑量依賴性。見圖3、表3。

表1 各組小鼠體質(zhì)量、移植瘤質(zhì)量和抑瘤率比較

圖1 各組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織HE染色圖(×400)Fig.1 HE staining of endometrial carcinoma tissues of mice in various groups(×400)Note:A.Model group;B.Low dose group;C.Medium dose group;D.High dose group.

2.5雷公藤甲素對子宮內(nèi)膜癌組織LncRNA-CCAT1 mRNA表達的影響 與對照組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜癌組織LncRNA-CCAT1 mRNA相對表達量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，低、中和高劑量雷公藤甲素組大鼠子宮內(nèi)膜癌組織LncRNA-CCAT1 mRNA相對表達量均明顯降低(P<0.05)，呈劑量依賴性，三組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

圖2 各組小鼠移植瘤細胞凋亡情況(×400)Fig.2 Apoptosis of transplanted tumor cells in various groups(×400)Note:A.Model group;B.Low dose group;C.Medium dose group;D.High dose group.

表2 各組小鼠移植瘤AI比較

圖3 各組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織免疫組織化學圖(×400)Fig.3 Immunohistochemistry of endometrial carcinoma tissues of mice in various groups(×400)Note:A.Model group;B.Low dose group;C.Medium dose group;D.High dose group.

表3 各組小鼠移植瘤組織caspase-3蛋白A值比較

表4 各組小鼠子宮內(nèi)膜癌組織LncRNA-CCAT1 mRNA表達水平

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率不斷上升，嚴重危害女性的生殖健康。目前臨床上對子宮內(nèi)膜癌的治療主要采取手術(shù)物理切除和化療等方法，但復發(fā)率高，副作用大。如何有效抑制子宮內(nèi)膜癌組織惡化一直是臨床腫瘤醫(yī)學的難題。雷公藤甲素是中藥雷公藤的有效成分，屬于環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物，其活性是雷公藤總苷的100倍，抗癌能力遠遠高于紫杉醇、絲裂霉素和阿霉素[11-14]。研究表明：雷公藤甲素對多種癌癥細胞株和腫瘤細胞的增殖和遷移有一定的抑制作用[15]。本研究結(jié)果表明，低、中和高劑量的雷公藤甲素均能明顯減輕荷瘤小鼠移植瘤質(zhì)量，明顯提高抑瘤率，說明不同劑量的雷公藤甲素對腫瘤生長有明顯的抑制作用。凋亡作為一種細胞選擇進化性的程序性死亡，參與細胞死亡的過程，有助于機體及時降解、消滅對整個機體造成危險的細胞，以及保證各種類型細胞之間的穩(wěn)態(tài)環(huán)境。本研究結(jié)果表明，與模型組比較，低、中和高劑量的雷公藤甲素組小鼠腫瘤組織凋亡細胞數(shù)均明顯增加；腫瘤組織caspase-3蛋白表達水平均明顯升高，caspase-3參與細胞凋亡啟動和整個凋亡過程的調(diào)控，以上結(jié)果均說明雷公藤甲素具有誘導癌細胞凋亡的作用[16，17]。

CCAT1是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種具有促癌作用的LncRNA，在多種腫瘤中異常高表達，能夠促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[18-20]。LncRNA CCAT1過表達能夠促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲，此外，通過競爭性結(jié)合微小RNA從而升高其靶基因Biml的表達水平，進一步增強細胞增殖和侵襲能力。本研究結(jié)果表明，低、中和高劑量雷公藤甲素組小鼠腫瘤組織中LncRNA CCAT1表達水平均明顯降低，說明其在腫瘤組織中表達水平的高低與子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖和凋亡密切相關(guān)，與研究報道一致，LncRNA CCAT1極有可能成為判斷癌癥發(fā)展程度的腫瘤標志物[21]。

綜上所述，雷公藤甲素對荷子宮內(nèi)膜癌小鼠移植瘤生長有一定抑制作用，其作用機制可能與降低LncRNA-CCAT1表達，下調(diào)caspase-3蛋白表達，促進腫瘤細胞凋亡有關(guān)。