尹明姬 池永學 李今子

(延邊大學附屬醫(yī)院，延吉 133002)

癲癇是一類常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其主要發(fā)病表現(xiàn)為大腦海馬區(qū)神經(jīng)元異常電位變化引起短暫的中樞神經(jīng)功能異常[1]。癲癇的發(fā)病受到多種遺傳因素和環(huán)境因素的影響，但其深入的致病機制還未闡明[2]。既往研究已經(jīng)表明，癲癇的發(fā)作常常伴隨細胞氧化應(yīng)激水平的升高，而且在癲癇的病理組織中，活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平顯著升高，因此氧化損傷與癲癇的發(fā)病密切相關(guān)[3,4]。

天麻素(gastrodin)是蘭科植物天麻塊根中提取的生物活性物質(zhì)，很多研究表明天麻素具有抗氧化、抗細胞凋亡、抗炎等功效，被用于癲癇的輔助治療[5,6]。有研究表明天麻素可以通過調(diào)控p38/Nrf2信號通路抑制神經(jīng)細胞SH-SY5Y的凋亡[7,8]，但其在癲癇治療中的具體機制還需要深入研究。本研究通過建立過氧化氫誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞氧化損傷模型，闡釋了天麻素是否通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路緩解氧化損傷引起的細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1材料 細胞培養(yǎng)所需的DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素、Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒、細胞活性氧探針H2FCAD均購自美國ThermoFisher公司；人超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)ELISA試劑盒購自美國Abcam公司，丙二醛(malondialdehyde，MDA)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)ELISA試劑盒均購自上海樊克生物技術(shù)公司；兔源抗Phospho-PI3 Kinase p85 (Tyr458)抗體購自美國CST公司(#17366)，鼠源抗p-Akt1/2/3(Thr308)抗體(#sc271964)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG及山羊抗鼠IgG均購自美國SantaCruz公司，天麻素購自美國Sigma公司，過氧化氫溶液購自上海生工公司。人視網(wǎng)膜神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y購自中國醫(yī)學科學院細胞庫SH-SY5Y細胞。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及實驗分組 SH-SY5Y細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)置對照組、氧化損傷組(H2O2)和天麻素處理組(H2O2+天麻素)，其中對照組細胞在正常條件下培養(yǎng)，氧化損傷組細胞在培養(yǎng)基中加入200 μmol/L過氧化氫(H2O2)，天麻素處理組同時加入200 μmol/L H2O2和10 μmol/L天麻素。

1.2.2流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 SH-SY5Y細胞經(jīng)過胰酶消化、離心棄上清，用Annexin-V結(jié)合緩沖液重懸細胞，并調(diào)整細胞密度至1×106個/ml，取100 μl細胞懸液加入5 μl FITC-Annexin-V和1 μl PI，室溫孵育15 min，加400 μl磷酸鹽緩沖液，隨后使用流式細胞儀檢測。

1.2.3流式細胞術(shù)檢測細胞ROS水平 SH-SY5Y細胞經(jīng)胰酶消化、離心后用磷酸鹽緩沖液重懸，清洗1次。隨后加入終濃度1 μmol/L H2DCFDA活細胞ROS指示劑，室溫孵育30 min，隨后離心去除染料，用DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，使用流式細胞儀檢測488 nm波長處激發(fā)熒光信號。

1.2.4ELISA 胰酶消化、離心并用磷酸鹽緩沖液重懸SH-SY5Y細胞，置于冰上，使用超聲破碎細胞，隨后12 000 r/min離心10 min，去除細胞碎片，保留上清細胞裂解液。每孔加入100 μl細胞裂解液或標準品加入96孔包被板中，室溫孵育2 h后洗滌3次，后加入酶標試劑100 μl，室溫孵育1 h后洗滌3次，分別加入顯色液避光放置15 min后加入終止液終止顯色。用酶標儀讀取每孔在450 nm的A值，并通過標準曲線計算SOD濃度。

1.2.5蛋白質(zhì)免疫印跡實驗 細胞裂解液加入5×SDS上樣緩沖液后，100℃沸水浴10 min，得到的蛋白樣品經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳分離，并使用濕轉(zhuǎn)法將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，隨后用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，并分別孵育一抗和辣根過氧化物酶標記的二抗，洗滌3次后加入化學發(fā)光底物，在凝膠成像儀下顯影。

2 結(jié)果

2.1Annexin-V/PI雙染法檢測細胞凋亡水平 與對照組相比，H2O2處理細胞8 h、24 h后，SH-SY5Y細胞凋亡水平顯著上升(8 h組：t=5.713，P=0.004 6；24 h組：t=8.77，P=0.000 9)。而H2O2聯(lián)合天麻素處理組細胞相較于H2O2處理組細胞凋亡水平顯著下降(8 h組：t=2.883，P=0.044 9；24 h組：t=4.145，P=0.014 3)，見表1。

2.2H2DCFDA染色檢測細胞ROS水平 與對照組相比，H2O2處理顯著提升了細胞內(nèi)ROS水平(t=15.9，P<0.000 1)，而H2O2聯(lián)合天麻素處理后細胞內(nèi)ROS水平顯著下降(t=7.294，P=0.001 9)，見圖1、表2。

2.3ELISA檢測細胞SOD、MDA、GSH-Px和LDH含量 與對照組相比，H2O2處理引起的氧化損傷導(dǎo)致細胞內(nèi)SOD表達水平下降(t=5.969，P=0.004)，MDA水平上升(t=6.839，P=0.002 4)，LDH水平上升(t=7.307，P=0.001 9)，GSH-Px水平下降(t=5.775，P=0.004 5)；而H2O2聯(lián)合天麻素處理后細胞內(nèi)SOD表達水平有一定程度的回升(t=3.492，P=0.025 1)，MDA水平下降(t=3.91，P=0.017 4)，LDH水平下降(t=4.105，P=0.014 8)，GSH-Px水平上升(t=4.429，P=0.014)，見表3。

表1 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡水平

圖1 流式細胞術(shù)檢測SH-SY5Y細胞內(nèi)ROS水平Fig.1 ROS levels in SH-SY5Y cells were measured by flow cytometry

表2 流式細胞術(shù)檢測各組細胞ROS水平

表3 ELISA檢測各組細胞SOD、MDA、LDH和GSH-Px表達

圖2 Western blot檢測各組細胞AKT、PI3K磷酸化修飾水平Fig.2 Expression of AKT and phosphorylation of PI3K in each group were measured by Western blotNote:Compared with control group,*.P<0.05;compared with H2O2 group,#.P<0.05.

2.4蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測PI3K/AKT信號通路 與對照組相比，H2O2處理引起的氧化損傷的細胞中，磷酸化AKT(p-AKT，分子量約60 kD)蛋白表達水平下降(t=25.1，P<0.000 1)，磷酸化PI3K(p-PI3K，分子量約80 kD)表達水平下降(t=39.35，P<0.000 1)；相較于H2O2單獨處理組，H2O2聯(lián)合天麻素處理組細胞p-AKT表達水平回升(t=3.905，P=0.017 5)，p-PI3K水平回升(t=4.11，P=0.0147)。

3 討論

天麻素在癲癇治療中的作用早有報道，并已經(jīng)作為輔助藥物應(yīng)用于癲癇的臨床治療之中，然而天麻素作用于神經(jīng)細胞的分子機制還缺少深入研究。本研究發(fā)現(xiàn)了天麻素在過氧化氫誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞的氧化損傷中能夠發(fā)揮保護作用，抑制過氧化氫誘導(dǎo)的細胞凋亡。過氧化氫處理的細胞會產(chǎn)生大量自由基，進而引起細胞的氧化應(yīng)激損傷和細胞凋亡。在癲癇的發(fā)病過程中通常會伴隨著ROS升高導(dǎo)致的神經(jīng)細胞的氧化損傷[3]。細胞內(nèi)高水平的ROS可以引發(fā)細胞的氧化應(yīng)激，使細胞內(nèi)蛋白氧化失活、DNA損傷以及線粒體等細胞器的功能紊亂[9]。過去的一些研究已經(jīng)利用動物模型實驗驗證了天麻素的在治療神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病中的作用，如在戊四唑誘導(dǎo)的小鼠驚厥模型中，天麻素可以抑制模型動物大腦中相關(guān)炎癥因子如IL-1β、TNF-α等的表達，并緩解小鼠癥狀[10]。此外，天麻素還被發(fā)現(xiàn)能夠抑制α-突觸核蛋白以及β淀粉樣蛋白在神經(jīng)元中的積累，對神經(jīng)退行性疾病如阿茲海默氏癥、帕金森癥中具有一定的治療作用[11,12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，天麻素處理的SH-SY5Y細胞可以通過上調(diào)SOD和GSH-Px的表達幫助細胞清除自由基，降低細胞內(nèi)的ROS水平，但天麻素是如何調(diào)控SOD和GSH-Px的表達還需要深入的研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)天麻素能夠激活氧化損傷細胞的PI3K/AKT信號通路。PI3K/AKT是調(diào)控細胞活性的重要信號通路，PI3K的磷酸化引發(fā)下游AKT蛋白的激活，進而影響細胞有絲分裂，促進細胞的增殖活性[13]。FoxO3是細胞響應(yīng)氧化應(yīng)激的一個重要轉(zhuǎn)錄因子，在活性氧刺激的細胞中，F(xiàn)oxO3發(fā)生磷酸化從胞漿轉(zhuǎn)運到細胞核中，并調(diào)控包括SOD在內(nèi)的多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，進而影響細胞的氧化應(yīng)激[14,15]。在神經(jīng)干細胞中，激活的AKT能夠磷酸化FoxO3，并促進其向細胞核轉(zhuǎn)運[16]。因此可以推測，在本研究所使用的過氧化氫誘導(dǎo)的SH-SY5Y的氧化損傷模型中，天麻素很可能通過PI3K/AKT信號通路激活FoxO3并上調(diào)SOD表達，清除細胞內(nèi)活性氧，抑制細胞凋亡。最近有研究表明，炎癥反應(yīng)在癲癇發(fā)病過程中也發(fā)揮了重要作用，而神經(jīng)元細胞的氧化損傷也是激活神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應(yīng)的主要因素之一[17]。天麻素是否能夠通過對免疫反應(yīng)的調(diào)控影響癲癇的疾病進展還需深入探討。