鐘秀波 繆繼東 李家偉 王 剛

(自貢市第四人民醫(yī)院腫瘤科，自貢 643000)

骨肉瘤是一種多發(fā)于兒童和青少年的惡性腫瘤，其具有高轉(zhuǎn)移率并且病情進(jìn)展快速、致死率高等特征，因此導(dǎo)致骨肉瘤患者臨床治愈率差[1,2]。骨肉瘤是骨科最難治療的腫瘤，其發(fā)生發(fā)展過(guò)程復(fù)雜，往往伴隨著炎癥因子的釋放和癌細(xì)胞、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[3,4]。目前有研究表明骨肉瘤發(fā)生的分子機(jī)制可能與腫瘤免疫有關(guān)，多種腫瘤免疫相關(guān)蛋白均參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等過(guò)程，而腫瘤免疫信號(hào)通路又與多種磷酸激酶相互作用，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到不同的作用[1，5，6]。目前臨床上常用的骨肉瘤化療藥物順鉑具有一定的副作用，例如腎毒性和嚴(yán)重的嘔吐，因此針對(duì)順鉑臨床應(yīng)用，降低其臨床使用劑量具有一定的臨床意義[7]。祖國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥博大精深，白花蛇舌草素作為一味傳統(tǒng)中藥具有增強(qiáng)免疫功能和抗腫瘤作用[8]。本研究采用順鉑聯(lián)合白花蛇舌草素體外給藥處理骨肉瘤細(xì)胞，觀察藥物聯(lián)合作用對(duì)骨肉瘤惡性生物學(xué)行為的影響及潛在的機(jī)制，為臨床上順鉑和白花蛇舌草素的聯(lián)合用藥提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1患者來(lái)源 本研究共納入2017年1月～2018年10月自貢市第四人民醫(yī)院收治的63例骨肉瘤患者和同期63例骨肉瘤患者正常組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均首次來(lái)院就診，并且經(jīng)過(guò)病理檢驗(yàn)科診斷證實(shí)，均未經(jīng)過(guò)任何治療；②無(wú)傳染病和血液傳染病；③兩組性別、年齡的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且均無(wú)其他骨病或系統(tǒng)性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有嚴(yán)重傳染性疾??；②對(duì)醫(yī)囑依從性差，無(wú)法配合研究者；③合并用藥嚴(yán)重感染、心腦血管疾病以及肝腎功能嚴(yán)重障礙者。本研究獲得自貢市第四人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意。

1.1.2試劑 骨肉瘤細(xì)胞系MG-63和Saos-2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；白花蛇舌草素(SX20190124)購(gòu)自四川省食品藥品檢驗(yàn)院；順鉑購(gòu)自Sigma公司(P4394)、蛋白定量試劑盒(P503021-0500)、SDS凝膠試劑盒(P0012A)、細(xì)胞裂解液(P0013)、結(jié)晶紫(P8470-25g)均購(gòu)自上海吉瑪生物有限公司；DMEM(SH30021)、胎牛血清(SH30406)、胰蛋白酶消化液(SV30042)購(gòu)自美國(guó) HyClone；青鏈霉素混合液(P1400)、4%多聚甲醛(P1110)、苯胺藍(lán)(28631-66-5)和蘇木素(C0107)均購(gòu)自武漢依科有限公司，β-actin(ab179577)、SRPK1(ab346089)和兔二抗(ab150077)購(gòu)自英國(guó)Abcam。PrimeScriptTMRT試劑盒(R0047A)和SYBR(RR1297)購(gòu)自中國(guó)TaKaRa。

1.2方法

1.2.1免疫組化染色 石蠟切塊進(jìn)行脫蠟和水化處理，抗原修復(fù)后滴加封閉液；1∶500稀釋HGF一抗孵育；孵育結(jié)束后用PBS進(jìn)行沖洗，加生物素標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育；PBS再次沖洗，滴加鏈親和素-過(guò)氧化酶溶液孵育。次日DAB顯色液顯色，蘇木素染液復(fù)染，中性樹(shù)脂膠固封；PBS作為一抗陰性對(duì)照組，陽(yáng)性細(xì)胞著色為棕黃色。

1.2.2CCK-8實(shí)驗(yàn) 調(diào)整MG-63和Saos-2細(xì)胞數(shù)為 4×105個(gè)/孔，Control組細(xì)胞直接鋪板，Cisplatin組細(xì)胞貼壁后給藥1.5 μmol/L(Cisplatin)，Cisplatin+HD組細(xì)胞貼壁后給藥1.5 μmol/L(Cisplatin)+30 μg/ml(HD)，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 d、2 d 和3 d。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入20 μl CCK-8，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育2 h，室溫于搖床振蕩10 min。酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)同一時(shí)間點(diǎn)OD 值，用測(cè)得的OD值進(jìn)行細(xì)胞增殖影響的分析。

1.2.3克隆形成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞分組同1.2.2，細(xì)胞接種5 d后每孔各加500 μl胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)。 貼壁生長(zhǎng)15 d后，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定15 min。固定后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，PBS 輕輕沖洗細(xì)胞，室溫風(fēng)干后計(jì)數(shù)多于50個(gè)細(xì)胞的克隆。

1.2.4qRT-PCR 細(xì)胞分組同1.2.2，培養(yǎng)箱設(shè)定37℃、5% CO2進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)36 h后收集細(xì)胞，向細(xì)胞中加入1 ml Trizol試劑以提取總RNA，嚴(yán)格按照PrimeScriptTMRT試劑盒的說(shuō)明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后加引物和SYBR Green。PCR反應(yīng)程序如下：95℃ 5 s，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s，40個(gè)循。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。使用β-actin作為參考標(biāo)準(zhǔn)，使用2-ΔΔCt計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列如下：β-actin：F 5′-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3′；R 5′-CACCACCCTGTTGCTGTAG-3′；SRPK1：F 5′-ATGCTTTCCTTCGACACCCGAT-3′；R 5′-TCCCTGGCGTCGACCAA-3′。

1.2.5Western blot 細(xì)胞分組同1.2.2，培養(yǎng)箱設(shè)定37℃、5% CO2進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞36 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌1 min后加含有蛋白酶抑制劑的裂解液放置冰上裂解，30 min后高速離心(13 000 r/min)吸取蛋白。蛋白定量完成后加上樣緩沖液，沸水煮5 min。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜成功后用脫脂牛奶進(jìn)行封閉，PBST清洗，均為1∶1 000稀釋?duì)?actin、PI3K及p-Smad7，室溫孵育1 h后4℃過(guò)夜。次日反復(fù)清洗條帶，加入兔二抗室溫孵育90 min，PBS反復(fù)沖洗，發(fā)光拍照。

1.2.6RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 檢測(cè)RNA質(zhì)量，首先用DNA酶Ⅰ處理RNA樣品防止樣品污染，隨后dT磁珠富集mRNA，再將mRNA片段化成短片段，合成cDNA的第一鏈，再進(jìn)行末端修復(fù)和腺嘌呤添加。最后，將測(cè)序銜接子連接到片段上，通過(guò)PCR擴(kuò)增富集片段。使用Agilent 2100 Bioanaylzer實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)對(duì)樣品庫(kù)進(jìn)行鑒定和定量，通過(guò)Illumina HiSeqTM4000對(duì)文庫(kù)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。比對(duì)數(shù)據(jù)用于計(jì)算參考基因的讀數(shù)分布和映射比率，進(jìn)行下游分析，包括基因表達(dá)和基于基因表達(dá)的深度分析(PCA，相關(guān)性，篩選差異表達(dá)的基因等)。

2 結(jié)果

2.1白花蛇舌草素抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖 分別用0～40 μg/ml白花蛇舌草素處理體外骨肉瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草素對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MG-63的抑制作用呈濃度依賴性，且作用3 d后 30 μg/ml白花蛇舌草素對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)以30 μg/ml為白花蛇舌草素作用濃度。見(jiàn)圖1。

2.2順鉑聯(lián)合白花蛇舌草素抑制了骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力 CCK-8(圖2A、C)和克隆形成實(shí)驗(yàn)(圖2B、D)結(jié)果均表明，順鉑和白花蛇舌草素聯(lián)合給藥可以顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力，其抑制作用明顯強(qiáng)于順鉑單獨(dú)給藥組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P<0.05)。

2.3順鉑聯(lián)合白花蛇舌草素抑制了骨肉瘤細(xì)胞的遷移能力 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示順鉑和白花蛇舌草素聯(lián)合給藥可以顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的劃痕愈合能力，并且其抑制作用強(qiáng)于順鉑單獨(dú)給藥組(圖3A、B)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4順鉑聯(lián)合白花蛇舌草素抑制了骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示順鉑和白花蛇舌草素聯(lián)合給藥可以顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力，并且其抑制作用強(qiáng)于順鉑單獨(dú)給藥組(圖4A、B)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5白花蛇舌草素給藥后降低骨肉瘤細(xì)胞SRPK1

圖1 不同濃度白花蛇舌草素對(duì)MG-63細(xì)胞增殖能力的影響Fig.1 Effects of different concentratin Hedyotis diffusa on proliferation of MG-63 cellsNote: ***.P<0.001.

的表達(dá) RNA-seq技術(shù)檢測(cè)順鉑給藥和聯(lián)合給藥組MG-63細(xì)胞給藥后各基因在RNA水平表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫相關(guān)蛋白SRPK1在聯(lián)合給藥后在MG-63細(xì)胞中下調(diào)明顯。推測(cè)白花蛇舌草素可能通過(guò)降低SRPK1的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)順鉑的抑瘤作用，隨后在RNA(圖5A)和蛋白水平(圖5B)分別在MG-63和Saos-2細(xì)胞水平進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SRPK1在順鉑和白花蛇舌草素聯(lián)聯(lián)合給藥組表達(dá)最低，且明顯低于順鉑單獨(dú)給藥組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 白花蛇舌草素增強(qiáng)順鉑抑制MG-63和Saos-2細(xì)胞增殖能力Fig.2 Hedyotis diffusa enhances ability of cisplatin to inhibit proliferation of MG-63 and Saos-2 cellsNote:A,C.CCK-8 test to detect the proliferation of MG-63 and Saos-2 cells by Hedyotisin combined with cisplatin;B，D.Clone formation test to test MG-63 and Saos-2 cell clone forming ability.**.P<0.01,***.P<0.001.

圖3 白花蛇舌草素增強(qiáng)順鉑抑制MG-63和Saos-2細(xì)胞劃痕愈合能力Fig.3 Hedyotis diffusa enhances ability of cisplatin to inhibit scratch healing of MG-63 and Saos-2 cellsNote:A.Scratch test to detect the healing of MG-63 cells in different treatment groups;B.Scratch test to detect healing of Saos-2 cells in different treatment groups.*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖4 白花蛇舌草素增強(qiáng)順鉑抑制MG-63和Saos-2細(xì)胞侵襲能力Fig.4 Hedyotis diffusa fortunei enhances invasive ability of cisplatin to inhibit MG-63 and Saos-2 cellsNote:A.Trans-well test detects the invasion ability of MG-63 cells in different treatment groups;B.Transwell test detects the invasion ability of Saos-2 cells in different treatment groups.*.P<0.05,**.P<0.01.

圖5 白花蛇舌草素聯(lián)合順鉑組MG-63細(xì)胞和Saos-2細(xì)胞SRPK1均表達(dá)降低Fig.5 Reduced expression of SRPK1 in MG-63 cells and Saos-2 cells of Hedyotis diffusa combined with cisplatin groupNote:A.RNA-seq differential gene heat map;B and C.qRT-PCR and western blot to detect SRPK1 expression in MG-63 cells in different treatment groups;D and E.qRT-PCR and Western blot to detect SRPK1 expression in Saos-2.**.P<0.01.

圖6 SRPK1在腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)Fig.6 SRPK1 expression in tumor tissues and normal tissuesNote:***.P<0.001.

圖7 白花蛇色草素提高順鉑對(duì)PI3K/AKT/TOR信號(hào)通路抑制Fig.7 Hedyotis diffusa enhances inhibition of PI3K/AKT/TOR signaling pathway by cisplatinNote:A.KEGG analysis of enrichment of differential fund pathways;B.Western blot detection of PI3K/AKT/TOR signal-related protein expression in MG-63 cells of different treatment groups.**.P<0.01,***.P<0.001.

2.6SRPK1在骨肉瘤組織中的表達(dá) 免疫組化染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，骨肉瘤組織中SRPK1表達(dá)明顯較多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖6)。

2.7白花蛇舌草素增強(qiáng)順鉑抑制PI3K/AKT/TOR信號(hào)通路作用 通過(guò)RNA-seq結(jié)果進(jìn)行KEGG分析，結(jié)果表明白花蛇舌草素給藥處理后骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)SRPK1下調(diào)倍數(shù)最明顯，同時(shí)KEGGE分析結(jié)果顯示其與PI3K/AKT/TOR信號(hào)通路相關(guān)，因此qRT-PCR檢測(cè)不同處理組骨肉瘤細(xì)胞PI3K/AKT/TOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的變化，結(jié)果顯示順鉑可以有效抑制PI3K和Akt蛋白磷酸化從而促進(jìn)mTOR的表達(dá)，而白花蛇舌草素進(jìn)一步加強(qiáng)抑制作用。見(jiàn)圖7。

3 討論

骨肉瘤因其具有高轉(zhuǎn)移和增殖能力，導(dǎo)致患者5年存活率較低[9]。臨床治療過(guò)程中骨肉瘤具有容易復(fù)發(fā)和治療效果不佳等特點(diǎn)[10]。順鉑是臨床治療骨肉瘤的常用化療藥物，具有一定的副作用[11]。隨著祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥研究的不斷深入，傳統(tǒng)中草藥對(duì)腫瘤的治療成為研究熱點(diǎn)。白花蛇舌草為一年生披散草本，其成藥味苦、淡，性寒，主要功效是清熱解毒、消痛散結(jié)、利尿除濕，尤善治療各種類型炎癥[12]。在臨床實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草素若配伍得當(dāng)，可治療多種疾病[13]。目前研究表明其提取物可以通過(guò)刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，增加白細(xì)胞吞噬功能以提高血清殺菌力，提高免疫功能，同時(shí)白花蛇舌草素在體內(nèi)對(duì)白血病細(xì)胞如急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞、急性淋巴性白血病細(xì)胞有抑制作用[14]；白花蛇舌草素素對(duì)小白鼠腹水肝癌細(xì)胞有抑制、殺滅作用[15]。

研究順鉑聯(lián)合白花蛇舌草素對(duì)MG-63和Saos-2細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組和順鉑單獨(dú)給藥組相比，聯(lián)合給藥組顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖作用，初步說(shuō)明白花蛇舌草素和順鉑聯(lián)合給藥起到協(xié)同抑瘤作用。用細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)聯(lián)合給藥對(duì)骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響，結(jié)果與增殖結(jié)果相似，聯(lián)合給藥組細(xì)胞不論是遷移能力還是侵襲能力均被顯著抑制，且抑制效果強(qiáng)于順鉑單獨(dú)給藥組。進(jìn)一步證實(shí)了二者的協(xié)同抑瘤作用。

為了探討其可能的作用機(jī)制，使用RNA-seq技術(shù)檢測(cè)順鉑聯(lián)合白花蛇舌草素組和順鉑單獨(dú)給藥組之間差異基因在RNA水平的變化，結(jié)果顯示腫瘤免疫相關(guān)蛋白SRPK1在聯(lián)合給藥組中的表達(dá)明顯低于順鉑單獨(dú)給藥組，因此推測(cè)白花蛇舌草素可能是通過(guò)抑制SRPK1的表達(dá)從而起到協(xié)同抑瘤作用，隨后檢測(cè)了兩種骨肉瘤細(xì)胞MG-63和Saos-2經(jīng)過(guò)不同給藥處理后SRPK1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不論在MG-63細(xì)胞還是Saos-2細(xì)胞SRPK1在聯(lián)合給藥組的表達(dá)最低，與RNA-seq結(jié)果相吻合。除了在體外的檢測(cè)外，進(jìn)一步在臨床腫瘤標(biāo)本進(jìn)行了免疫組化染色檢測(cè)SRPK1的表達(dá)，結(jié)果顯示SRPK1在骨肉瘤腫瘤組織中的表達(dá)顯著高于正常組織。說(shuō)明SRPK1對(duì)骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展起到促進(jìn)作用，而白花蛇舌草素可以通過(guò)抑制腫瘤免疫相關(guān)蛋白SRPK1的表達(dá)與順鉑聯(lián)合給藥有效抑制了骨肉瘤細(xì)胞在體外的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等一系列惡性生物學(xué)行為。

文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)敲低SOX2靶向抑制SRPK1介導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路抑制皮膚基底細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[16]；miR-216b 通過(guò)靶向SRPK1抑制大結(jié)腸癌的增殖、遷移和侵襲[17]；靶向作用SRPK-1的嵌合抗體可以抑制非小細(xì)胞肺癌增殖、遷移和侵襲[18]；microRNA-1296通過(guò)靶向SRPK1介導(dǎo)的PI3K/AKT途徑來(lái)抑制肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[19]。而KEGG分析結(jié)果進(jìn)一步顯示在骨肉瘤中白花蛇舌草素同樣作用于PI3K/AKT/TOR信號(hào)通路，蛋白分析結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了KEGG分析結(jié)果，白花蛇舌草素可以提高順鉑抑制PI3K和Akt蛋白磷酸化的作用，從而抑制PI3K/AKT/TOR信號(hào)通路的激活。但是在骨肉瘤中PI3K/AKT/TOR信號(hào)通路與SRPK1的關(guān)系如何，對(duì)其腫瘤免疫機(jī)制的研究將成為下一步重點(diǎn)關(guān)注的研究熱點(diǎn)。