陳俊伊 唐 弘 莊稀堯 熊雨菡 唐 霞 楊 春

(重慶醫(yī)科大學，重慶 400010)

人腸道病毒D68型(human enterovirus D68，EV-D68)是腸道病毒屬的小RNA病毒，1962年首次提取于4名呼吸系統(tǒng)疾病患兒[1，2]。在臨床上,EV-D68主要引起呼吸系統(tǒng)疾病，嚴重可能會引起中樞神經系統(tǒng)疾病[1]。EV-D68病毒是一個沒有包膜的正二十面體，遺傳物質為7.5 kb的單股正鏈RNA分子。其只有一個開放閱讀框，編碼1個前體蛋白，可被自身的蛋白酶裂解成7種非結構蛋白和4種結構蛋白。7種非結構蛋白為：2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D，4種結構蛋白為：VP1、VP2、VP3和VP4[3]。在EV-D68的4種結構蛋白中,VP1蛋白作用尤為顯著。小RNA病毒科的 VP1蛋白是劃分屬的參考，腸道病毒屬內VP1蛋白是血清型分類的依據。VP1蛋白位于EV-D68衣殼蛋白最外層，具有主要的免疫原性表位和中和表位[3，4]。其含有8個β鏈(B、C、D、E、F、G、H和I)，這些鏈由7個環(huán)結構(BC、CD、DE、EF、FG、GH和HI環(huán))連接，研究表明抗原表位可能位于VP1蛋白的環(huán)結構上[5，6]。然而,要確定病毒的抗原表位需要更詳盡的實驗。本研究采用生物信息學方法分析EV-D68的VP1蛋白，探討其理化性質和結構功能，預測最佳的B細胞抗原表位，并篩選出最有可能產生中和抗體的肽段，為后期疫苗的研究提供依據。

1 資料與方法

1.1資料 VP1氨基酸(amino acid,aa)序列和生物信息學工具:從NCBI數據庫檢索EV-D68的Fermon株全長aa序列(NC_038308.1)，選擇VP1序列(YP_009508944.1)進行分析。本研究主要利用Bioedit軟件、ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)、ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)、Netphos (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)、SignaIP 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)、TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)、SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)、Predictprotein (https://www.predictprotein.org/)、swissmodel(https://www.swissmodel.expasy.org/)、PROCHECK(http://servicesn.mbi.ucla.edu/PROCHECK/)、ERRAT(http://services.mbi.ucla.edu/ERRAT/)、Phyre(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)、RasMol 2.7.5、ABCpred(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/index.html)、IEDB(http://www.iedb.org/home_v3.php)等線上工具分析VP1。

1.2方法

1.2.1VP1的理化性質預測 應用Bioedit軟件分析VP1蛋白aa組成；ProtParam工具預測其分子式、分子量、等電點、摩爾消光系數、不穩(wěn)定系數和半衰期。

1.2.2VP1的結構功能和B細胞抗原表位預測 應用ProtParam分析VP1蛋白的脂溶指數及親水系數，ProtScale中K-D法分析其疏水性；Netphos工具分析其磷酸化位點；SignaIP 4.0 Server在線工具,運用神經網絡法分析其信號肽；TMHMM在線工具預測其跨膜結構域；分別應用SOPMA和Predictprotein預測其二級結構；Swissmodel、RasMol2及Phyre分析其三級結構；ABCpred預測其B細胞表位；IEDB在線軟件分析其線性表位、β-轉角、表面可及性、可塑性、抗原及親水性。

2 結果

圖1 EV-D68 VP1的aa組成分布圖Fig.1 Aa composition of EV-D68 VP1

2.1aa的組成 結果表明，VP1由309個aa組成，其中有蘇氨酸(Thr)31個,占10.03%；丙氨酸(Ala)28個，占9.06%；天冬酰胺(Asn)24個，占7.77%；纈氨酸(Val)23個,占7.44%，絲氨酸(Ser)22個，占7.12%。VP1共含堿性aa 37個，占總aa數的12.0%；酸性aa 25個,占總aa數的8.1%(圖1)。

2.2基本理化性質 VP1蛋白相對分子質量為34.0 kD，等電點是8.73。VP1蛋白的胱氨酸殘基形成半胱氨酸(Cys)形式的二硫鍵，在水溶液中(A280 nm)摩爾消光系數為31 525 L(mol·cm);VP1蛋白的胱氨酸殘基不形成二硫鍵,在水溶液中(A280 nm)的摩爾消光系數為31 400 L/(mol·cm)。VP1蛋白質的N末端是Ser，其在哺乳動物網織紅細胞中半衰期為1.9 h，在酵母中大于20 h，在大腸桿菌中大于10 h。其不穩(wěn)定性系數為33.92，小于閾值40，表明該蛋白在溶液中穩(wěn)定，屬于穩(wěn)定蛋白質。

2.3疏水性分析 分析得出VP1蛋白脂溶指數為77.35,平均親水性系數(GRAVY)為-0.221，GRAVY負值表明該蛋白質為親水性蛋白質。VP1蛋白疏水性如圖2所示，其親水性aa分布相對均勻，第87位aa(谷氨酸，Glu)得分最低，為-2.356，表明該位點為VP1蛋白中最親水的aa位點；第135位aa(Thr)得分最高，為2.322，表明該位點為VP1蛋白中最疏水的aa位點。以上結果提示此蛋白屬于親水性蛋白。

2.4磷酸化位點 如圖3所示，軟件預測VP1蛋白有35個磷酸化位點，其中有15個Ser位點，16個Thr位點，和4個酪氨酸(Tyr)位點。

2.5信號肽和跨膜螺旋 對VP1蛋白信號肽分析結果如圖4，VP1蛋白的信號肽預測值為0.103，小于閾值0.45，提示其屬于非分泌性蛋白；VP1的跨膜結構域分析結果見圖5，VP1蛋白完全位于膜外，表明VP1蛋白質不具有跨膜結構域。

圖2 EV-D68 VP1疏水性分析Fig.2 Hydrophobicity analysis of EV-D68 VP1

圖3 EV-D68 VP1磷酸化位點預測Fig.3 Prediction of phosphorylation sites in EV-D68 VP1

圖4 EV-D68 VP1信號肽預測Fig.4 Prediction of signal peptide of EV-D68 VP1

2.6二級結構預測 使用SOPMA進行VP1蛋白質的二級結構，預測結果示于圖6。在VP1蛋白的二級結構中，α-螺旋占比20.39%,β-折疊占比23.30%,β-轉角占比3.24%,無規(guī)則卷曲占比53.07%；應用Predictprotein預測VP1蛋白的二級結構結果如圖7，α-螺旋比例為9.06%，β-折疊比例為25.89%，無規(guī)卷曲比例為65.05%。

圖5 EV-D68VP1跨膜螺旋預測Fig.5 Prediction of transmembrane helices in EV-D68 VP1

圖6 SOPMA軟件預測EV-D68 VP1蛋白二級結構Fig.6 Prediction of secondarystructure of EV-D68 VP1 by tool SOPMA

結合兩種方法對VP1蛋白二級結構的預測,分析VP1蛋白二級結構。無規(guī)則卷曲在蛋白質中占比最高，且有少量β-轉角存在于其中，是蛋白質的柔性區(qū)域，這些區(qū)域更可能存在抗原表位。α-螺旋和β-折疊在VP1蛋白中散落分布,是蛋白的剛性支撐區(qū)域。

2.7三級結構 應用swissmodel預測VP1蛋白的三級結構并同源建模。選擇4wm7.1.A為模板，模板序列與目的蛋白序列相似度為0.61，GMQE為0.966。用PROCHECK軟件評估模型，結果顯示有2個Errors,4個Warning,3個Pass；用ERRAT軟件評估模型，得分為88.281 2。綜合評估結果，顯示模型構建較為合理，有較強精確性，結果見圖8。

Phyre在線分析EV-D68 VP1蛋白三級結構,軟件以c4wm8A為模板，構建的蛋白序列覆蓋率為 91%，可信度達到 100.0%。通過RasMol 2.7.5軟件顯示VP1蛋白的三級結構，結果見圖9。

2.8B細胞表位 應用ABCpred預測VP1蛋白的B細胞表位，采用遞歸神經網絡計算方法,設置閾值為0.70，結果見圖10。有29條肽鏈得分達到或超過閾值，被預測為VP1蛋白的B細胞表位，表明VP1蛋白具有很好的免疫原性。

圖7 Predictprotein預測EV-D68 VP1的二級結構Fig.7 Prediction of secondary structure of EV-D68 VP1 by Predictprotein

圖8 Swissmodel預測EV-D68 VP1蛋白的三級結構Fig.8 Prediction of tertiary structure of EV-D68 VP1 by Swissmodel

IEDB在線軟件分析線性表位、β-轉角、表面可及性、可塑性、 抗原、 親水性6個方面，結果如圖11所示，綜合6個結果和ABCpred在線軟件的預測結果，結合高級結構和理化性質結果篩選比較，預測第39～59、82～102、136～153、163～181、256～271、275～289位aa成為VP1蛋白抗原表位的可能性較大。

圖9 Phyre構建EV-D68 VP1蛋白的三級結構Fig.9 Prediction of tertiary structure of EV-D68 VP1 by PhyreNote:A.Cartoons mode;B.Stick mode;C.Spacefill mode.Red area is α-helix，yellow area is β-fold，blue area is corner，and others are white.

圖10 ABCpred預測EV-D68 VP1蛋白的B細胞表位Fig.10 Prediction of B-cell epitope of EV-D68 VP1 by ABCpred

圖11 IEDB預測EV-D68 VP1蛋白的B細胞表位Fig.11 Prediction of B-cell epitope of EV-D68 VP1 by IEDBNote:A.Bepipred linear epitope prediction;B.Chou & fasman β-turn prediction;C.Emini surface accessibility prediction;D.Karplus & schulz flexibility prediction;E.Kolaskar & tonga onkar antigenic-ity;F.Parker hydrophilicity prediction.

3 討論

近年來全球各地頻繁暴發(fā) EV-D68感染疫情,中國、英國、泰國、意大利、菲律賓、法國、新西蘭、肯尼亞、日本、荷蘭等均國家報告了EV-D68的檢出[7]。EV-D68感染的常見癥狀包括流鼻涕、嚴重咳嗽、哮喘和肌肉疼痛等[1]。臨床并發(fā)癥包括呼吸道感染、支氣管炎、肺炎、手足口病、松弛性癱瘓和新生兒敗血癥等。研究表明，EV-D68可引起嚴重的呼吸道疾病，加劇哮喘和肺炎的臨床癥狀，誘發(fā)致命的神經系統(tǒng)感染及嚴重的心肺功能衰竭，最終導致死亡[8]。然而目前仍未研發(fā)出特異性預防 EV-D68感染的疫苗。

目前,對蛋白進行生物信息學分析已成為很多表位和疫苗研究的首選方法，與傳統(tǒng)實驗方法相比，生物信息學技術分析蛋白結構和表位預測更加高效、準確[9-11]。有研究顯示VP1蛋白是小RNA病毒衣殼蛋白中最外部、最具免疫優(yōu)勢的蛋白[12]。許多主要中和位點存在于小RNA病毒的VP1蛋白[4，13]。目前，利用生物信息學技術分析篩選EV-D68的B細胞表位和候選疫苗肽段鮮有報道。本研究使用ABCpred軟件預測EV-D68 VP1蛋白B細胞表位[14]。人工神經網絡模型具有多個互聯處理單元，是一個并行分布、非線性、自適應的信息處理系統(tǒng)。該系統(tǒng)用Bcipep數據庫的700種非冗余B細胞表位和Swiss-Prot數據庫的10～20個aa殘基的700種隨機肽進行檢驗，當預測表位的長度為16個aa時，總精度接近66%[15]。結合蛋白的二級結構和物理化學性質篩選出β轉角區(qū)域和無規(guī)則卷曲區(qū)域為良好的抗原表位區(qū)[16]。

病毒的感染和復制通過復雜的信號轉導通路控制。蛋白質的磷酸化調控是基本手段之一。在特定位點或特定時間發(fā)生aa磷酸化，將信號從細胞膜引入細胞核，引發(fā)一系列下游蛋白質翻譯以適應細胞需求[17]。此次分析發(fā)現，VP1蛋白具有很多磷酸化位點，提供了打開和關閉信號通路的分子基礎。VP1蛋白的二級結構具有很多α-螺旋和無規(guī)則卷曲，與其他腸道病毒VP1蛋白的既往研究相結合，VP1蛋白很可能在病毒感染過程中起重要的信號轉導作用,是預防、治療病毒感染的關鍵靶點[18]。

本研究對EV-D68的VP1蛋白進行了生物信息學分析,預測了其基本理化性質、結構功能和B細胞表位，在后續(xù)實驗中，本團隊將在預測的第39～59、82～102、136～153、163～181、256～271、275～289位中篩選出2～3個最佳表位合成抗原肽，免疫小鼠獲得中和抗體，探討其阻止病毒黏附等能力，同時，比較合成抗原肽和原核表達及真核表達的VP1蛋白的中和作用等，為后期疫苗開發(fā)奠定理論基礎。