雷 敏，劉 斌，阮梅林，羅 云

（華中科技大學(xué) 生命科學(xué)研究共享平臺，湖北 武漢 430074）

蛋白質(zhì)分子量是蛋白的重要特征參數(shù)，同時是研究蛋白均一性、聚集狀態(tài)和蛋白間相互作用等特征參數(shù)的基礎(chǔ)。因此，準(zhǔn)確有效地測定蛋白質(zhì)分子量非常關(guān)鍵[1-2]。傳統(tǒng)測定蛋白質(zhì)分子量的方法主要包括凝膠電泳法[3]、高效凝膠過濾色譜-多角度激光光散射法[4]、電噴霧離子化質(zhì)譜法[5]以及基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法[6-7]。其中凝膠電泳法和凝膠色譜法操作復(fù)雜，對樣品的需求量高，受樣品的形狀和尺寸影響較大，結(jié)果準(zhǔn)確度低[8]。電噴霧離子化質(zhì)譜法和基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法是近幾年發(fā)展迅速的生物大分子測定技術(shù)，也是目前測定蛋白質(zhì)分子量的主要方法[2]。近年來，由于分析超速離心法在測定蛋白質(zhì)分子量的同時，可從相同數(shù)據(jù)組中同時分析出待測蛋白的均一性、聚集狀態(tài)、化學(xué)計量比和分子構(gòu)象等多項特征參數(shù)，且該方法具有樣品需求量少、無需標(biāo)準(zhǔn)品、無破壞性和普適性高等諸多優(yōu)勢，受到越來越多的研究者青睞[8-19]。

已有的文獻(xiàn)報道主要基于利用該方法測定蛋白質(zhì)分子量或其特征參數(shù)，但對于檢測過程中樣品的初始濃度、離心轉(zhuǎn)速等實(shí)驗條件的改變是否會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響并未提及。而研究各項實(shí)驗條件的影響并篩選出合適的參數(shù)，對于準(zhǔn)確測定蛋白質(zhì)分子量及其他特征參數(shù)具有重要的意義。因此，本文以牛血清蛋白（albumin bovine serum，BSA）和人血清免疫球蛋白（human serum immunoglobulin G，IgG）作為研究對象，在分析超速離心-沉降速率（sedimentation velocity of analytical ultracentrifugation，AUC-SV）模式下，探究了樣品初始濃度、離心轉(zhuǎn)速和樣品上樣體積等實(shí)驗條件對測定結(jié)果的影響。在優(yōu)化的實(shí)驗條件下，建立了 AUC-SV 測定蛋白質(zhì)分子量的方法，同時可為AUC-SV 初學(xué)者提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器

分析型超速離心機(jī) ProteomeLab XL-I（美國Beckman 公司），型號為An-60 Ti 的4 孔轉(zhuǎn)頭，使用2-channel 樹脂中心件和藍(lán)寶石窗口組裝樣品池；紫外超微量分光光度計NanoDrop2000（Thermo 公司）；基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜MALDI-TOF/TOF MS 5800（美國AB SCIEX 公司）。

1.2 試劑

BSA（≥98%）標(biāo)準(zhǔn)品購自Biofroxx 公司；IgG（≥95%）標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma 公司；Tris(hydroxymethyl)aminomethane（試劑純，≥99%）購自Sigma 公司；磷酸鹽溶液（phosphate buffered solution, PBS）購自北京Biosharp 公司；NaCl（分析純）購自上海滬試公司。

1.3 AUC-SV

分別在分析型超速離心機(jī)中注入400 μL pH 8.0 PBS 和380 μL 樣品溶液。樣品濃度采用紫外超微量分光光度計進(jìn)行測定，記錄樣品在280 nm 處的吸光度A280。設(shè)置紫外檢測波長為280 nm，掃描頻率為6 min/次，在4 ℃及40 000 r/min 的條件下離心，待樣品全部離心至池底時停止掃描和離心。使用SEDFIT軟件[20]對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析后可得蛋白質(zhì)分子量。

1.4 實(shí)驗條件的優(yōu)化

實(shí)驗條件的優(yōu)化按照樣品初始濃度、離心轉(zhuǎn)速、離心時間、離心溫度、樣品上樣體積和緩沖液體系的順序進(jìn)行，每次只改變單一實(shí)驗條件，已優(yōu)化的實(shí)驗條件直接應(yīng)用到后續(xù)的分析中，待優(yōu)化的實(shí)驗條件則參考節(jié)1.3。

1.5 質(zhì)譜法測定蛋白質(zhì)分子量

使用基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜，在Linear High Mass Positive 模式下，以芥子酸為基質(zhì)，測定未知蛋白質(zhì)分子量。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品初始濃度的選擇

樣品性質(zhì)不同及儀器性能差異均可能影響到樣品適合的初始濃度。首先測定了BSA 和IgG 初始濃度A280分別為0.1、0.4、0.7、1.0、1.2 Abs 時的分子量，結(jié)果如表1 所示。從表1 可以看出，在上述濃度范圍內(nèi)，擬合得到的BSA 和IgG 分子量均與標(biāo)準(zhǔn)分子量接近，相對誤差在±5%以內(nèi)。但通過對擬合得到的峰形進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)BSA 在A280為0.1 Abs 時，峰形延展較寬，擬合得到的分子量分布較實(shí)際范圍寬。而A280為1.2 Abs 時，兩者的紫外掃描誤差達(dá)到±0.05 Abs，超過儀器允許范圍(±0.02 Abs)。因此，在進(jìn)行未知蛋白質(zhì)分子量檢測時，建議調(diào)節(jié)樣品初始濃度A280在0.4～1.0 Abs 之間。

表1 不同樣品初始濃度下的分子量擬合結(jié)果

2.2 離心轉(zhuǎn)速的選擇

樹脂中心件能承受的最高轉(zhuǎn)速為40 000 r/min，因此比較了轉(zhuǎn)速在40 000、30 000、20 000 r/min 下的擬合結(jié)果，如表2 所示。在相同的離心轉(zhuǎn)速下，分子量較大的IgG 離心沉底的時間較短。在20 000 r/min時，樣品經(jīng)20 h 的長時間離心后仍然未能沉底。3 個轉(zhuǎn)速條件下擬合得到的分子量與標(biāo)準(zhǔn)分子量接近，相對誤差均在±2%以內(nèi)。這說明離心轉(zhuǎn)速對擬合結(jié)果影響不明顯，但轉(zhuǎn)速越低，離心時間要求越長，因此選擇40 000 r/min 可快速高效獲得蛋白質(zhì)分子量。

2.3 離心時間的選擇

分析節(jié)2.2 所述（40 000 r/min）不同離心時間的數(shù)據(jù)，結(jié)果如表3 所示。BSA 離心到池底需要10 h，IgG 需要 6 h，擬合得到的分子量分別為 68.0 和150 kDa，與標(biāo)準(zhǔn)分子量一致。當(dāng)離心時間較短（3～6 h）時，未離心到池底的數(shù)據(jù)經(jīng)擬合得到的分子量與標(biāo)準(zhǔn)分子量也較為接近，相對誤差在±3%以內(nèi)。IgG離心時間9 h 及以上，分子量相對誤差逐漸增大，由-5.33%增加到-7.33%，這是由于樣品沉底后，所采集到的數(shù)據(jù)濃度變化不明顯，有效數(shù)據(jù)減少，從而導(dǎo)致擬合誤差增大。因此，當(dāng)樣品離心到池底時即可停止離心，同時在進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合時應(yīng)注意選取擬合區(qū)間，避免導(dǎo)入重復(fù)的沉底數(shù)據(jù)。

表2 不同離心轉(zhuǎn)速下的分子量擬合結(jié)果

表3 不同離心時間下的分子量擬合結(jié)果

2.4 離心溫度的選擇

BSA 和IgG 在溶液狀態(tài)下穩(wěn)定存在的最適溫度均為4 ℃，而SEDFIT 軟件擬合參數(shù)默認(rèn)溫度為20 ℃。因此對比了在4、10、20 ℃條件下的擬合結(jié)果，如表4所示。由表4 可知，4 ℃條件下擬合得到的分子量與標(biāo)準(zhǔn)分子量一致，隨著溫度升高，相對誤差明顯增大。而根據(jù)擬合得到的峰形及峰的數(shù)量來看，BSA 和IgG在3 個溫度條件下均未出現(xiàn)明顯分解或聚集現(xiàn)象，誤差增大的原因可能是隨著溫度升高，溶液的黏度降低，樣品沉降系數(shù)變小，從而分子量測定結(jié)果偏低[21]。此外，可推斷在此實(shí)驗條件下，SEDFIT 軟件擬合時對溫度的要求并不嚴(yán)苛，因此對于未知蛋白質(zhì)，可選擇在其穩(wěn)定的溫度下進(jìn)行離心即可。

表4 不同離心溫度下的分子量擬合結(jié)果

2.5 樣品上樣體積的選擇

對上樣體積分別為100、200、380 μL 的實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行了比較，如表5 所示。隨著上樣體積的減少，BSA 和IgG 擬合得到的分子量與標(biāo)準(zhǔn)分子量之間的相對誤差都變大，且IgG 的相對誤差高于10%。這是由于樣品上樣體積減小，樣品池的有效掃描半徑和數(shù)據(jù)擬合區(qū)間縮短，導(dǎo)致擬合的有效數(shù)據(jù)量減少。此外，離心過程中IgG 的沉降速度更快，IgG 的有效擬合數(shù)據(jù)較BSA 少，導(dǎo)致擬合得到的IgG 分子量相對誤差較BSA 更大。因此建議對12mm 2-channel 樹脂中心件的上樣體積為380 μL。

表5 不同上樣體積的分子量擬合結(jié)果

2.6 緩沖體系的選擇

比較了BSA 和IgG 在水、PBS 和150mmol/L NaCl-50mmol/L Tris 混合溶液3 種溶劑體系的實(shí)驗結(jié)果，如表6 所示。BSA 和IgG 在3 種溶液中均能穩(wěn)定存在，測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)分子量接近。但已有文獻(xiàn)報道，測量帶電體系時需要加入小分子鹽以屏蔽溶質(zhì)分子間靜電相互作用，以消除靜電相互作用對分子在溶液中運(yùn)動產(chǎn)生的影響[22]。如對于多數(shù)等電點(diǎn)在4～5 之間的蛋白質(zhì)，建議采用pH 范圍在7～9 之間的緩沖溶液。

表6 樣品在不同緩沖體系中的分子量擬合結(jié)果

2.7 未知蛋白質(zhì)樣品分析

在上述優(yōu)化的實(shí)驗條件下，以PBS 為緩沖體系，測定未知蛋白質(zhì)的分子量，并與質(zhì)譜測定結(jié)果進(jìn)行比較，如圖1 所示，表示蛋白質(zhì)濃度c 分布與沉降系數(shù)s 分布的對應(yīng)關(guān)系。AUC-SV 法和MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜法測得該蛋白質(zhì)分子量分別為39.9 kDa（圖1(a)）和40.0 kDa（圖1(b)），兩者測定結(jié)果一致，說明該方法可用于測定其他蛋白質(zhì)的分子量。

圖1 未知蛋白質(zhì)分子量測定結(jié)果

3 結(jié)論

本文通過對AUC-SV 實(shí)驗條件研究發(fā)現(xiàn)：離心轉(zhuǎn)速在20 000～40 000 r/min 對測定結(jié)果無明顯影響，但離心轉(zhuǎn)速越大，離心時間越短，建議優(yōu)先選擇40 000 r/min，以快速獲得實(shí)驗結(jié)果。樣品初始濃度、離心時間、離心溫度和緩沖液體系的適宜范圍則較寬，樣品上樣體積對測定結(jié)果的影響顯著，建議對于12mm 2-channel 樹脂中心件的上樣體積為380 μL。在優(yōu)化的實(shí)驗條件下，測得未知蛋白質(zhì)的分子量為39.9 kDa，與質(zhì)譜法測定結(jié)果（40.0 kDa）一致。該方法具有適宜條件范圍寬、非破壞性、無需標(biāo)準(zhǔn)品和普適性高等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于未知蛋白質(zhì)分子量的測定，其主要缺點(diǎn)則是對樣品的純度要求較高[23]，否則測定結(jié)果可能會受到雜質(zhì)干擾。此外，本文詳細(xì)探討了各項實(shí)驗條件對測定結(jié)果的影響，可供AUC-SV 初學(xué)者學(xué)習(xí)借鑒。