王宏剛，魏 遠(yuǎn)，陳成彬，王春國(guó)，宋文芹，白艷玲，黃桂安,2

（1.南開(kāi)大學(xué) 生物國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，天津 300071；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109）

減數(shù)分裂是一種發(fā)生在真核生物有性生殖細(xì)胞形成過(guò)中的一種特殊的有絲分裂形式，是生物遺傳和變異的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[1-2]。同源染色體聯(lián)會(huì)與重組是發(fā)生在減數(shù)分裂前期I 的重要生理活動(dòng)。近年來(lái)，對(duì)同源染色體聯(lián)會(huì)與重組的研究已經(jīng)成為減數(shù)分裂領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[3-4]。隨著教學(xué)改革的深入，各個(gè)高校越來(lái)越重視科研前沿技術(shù)在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用[5-6]。通過(guò)在實(shí)驗(yàn)課程中開(kāi)設(shè)減數(shù)分裂同源染色體聯(lián)會(huì)與重組觀察實(shí)驗(yàn)，可以幫助學(xué)生對(duì)同源染色體聯(lián)會(huì)與重組過(guò)程中聯(lián)會(huì)復(fù)合體和重組節(jié)形成直觀的認(rèn)識(shí)，讓他們更加了解同源染色體聯(lián)會(huì)與重組的過(guò)程。教學(xué)過(guò)程中，首先制作小鼠精母細(xì)胞的染色體展片，然后通過(guò)免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)對(duì)聯(lián)會(huì)復(fù)合體蛋白SCP1 和SCP3 的熒光標(biāo)記，最后在熒光顯微鏡下觀察減數(shù)分裂前期I 各時(shí)期聯(lián)會(huì)復(fù)合體的特點(diǎn)。另外，使用MLH1（MutL homologue 1）的單克隆抗體對(duì)聯(lián)會(huì)復(fù)合體上的重組節(jié)進(jìn)行標(biāo)記，可以對(duì)減數(shù)分裂中的同源重組現(xiàn)象進(jìn)行觀察。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與器材

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

正置熒光顯微鏡、離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材

染色缸、濕盒、封口膜、1.5 mL 離心管、剪刀、鑷子、一次性培養(yǎng)皿、移液器。

2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

成年雄性小鼠。

2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

抗小鼠SCP3 抗體（山羊來(lái)源）、抗小鼠SCP1 抗體（兔來(lái)源）、抗小鼠MLH1 抗體（兔來(lái)源）、FITC標(biāo)記的抗山羊抗體、Rhodamine 標(biāo)記的抗兔抗體、FITC標(biāo)記的抗兔抗體、Rhodamine 標(biāo)記的抗山羊抗體、PBS-T（在PBS 中加入終濃度為0.1%的Trion X 100）、5% BSA（稱(chēng)取0.5 g BSA 溶于10 mL PBS-T 中）、PBS、100mmol/L 蔗糖溶液、1% PFA、0.4% Photoflo、封片劑、DAPI、70%乙醇。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 減數(shù)分裂染色體展片的制備

斷頸法處死小鼠，用70%乙醇對(duì)小鼠進(jìn)行消毒處理。取出小鼠的睪丸放入盛有PBS 的一次性培養(yǎng)皿中。用鑷子將睪丸表面的白膜除去，拉出長(zhǎng)段的曲細(xì)精管。取長(zhǎng)約5 cm的曲細(xì)精管，放入盛有200 μL PBS的1.5 mL離心管中，用剪刀將曲細(xì)精管剪碎。補(bǔ)加PBS 至1 mL，然后用移液器吹打多次，使細(xì)胞盡量從曲細(xì)精管中游離出來(lái)。室溫靜置1 min，取上清。200 g 離心3 min，PBS 漂洗細(xì)胞2 次。細(xì)胞沉淀用100～200 μL 的100mmol/L蔗糖溶液重懸，制成細(xì)胞懸液。用1% PFA 溶液浸潤(rùn)載玻片，取40 μL 細(xì)胞懸液滴到載玻片中央，濕盒中放置3 h。取出載玻片充分晾干，用0.4% Photoflo 清洗2 min，晾干后放入載玻片盒，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 小鼠SCP3 蛋白和SCP1 蛋白的免疫熒光標(biāo)記

取出制備好的減數(shù)分裂染色體展片標(biāo)本，使用PBS-T 洗10 min。滴加50 μL 5% BSA 至一塊比載玻片稍小封口膜上，將染色體展片標(biāo)本倒扣到封口膜上，放入濕盒處理0.5～1 h。去掉封口膜，去除封閉液。將1∶100 稀釋的抗小鼠SCP3 抗體（山羊來(lái)源）和抗小鼠SCP1 抗體（兔來(lái)源）等體積混合，取20 μL 抗體混合液滴到封口膜上，將載玻片反扣到封口膜上，濕盒中室溫孵育1 h。孵育完成后，用PBS-T 漂洗載玻片3 次，每次10 min。將1∶100 稀釋的FITC-抗山羊二抗和Rhodamine-抗兔二抗等體積混合，取20 μL 熒光二抗混合液滴加到新的封口膜上，載玻片反扣到封口膜上，濕盒中室溫避光孵育0.5～1 h。孵育完成后，用PBS-T 漂洗載玻片3 次，每次10 min。晾干后，取15 μL 封片劑至載玻片上，蓋上蓋玻片，用指甲油封住邊緣。正置熒光顯微鏡下，使用綠色熒光模塊對(duì)SCP3 進(jìn)行觀察和拍照，使用紅色熒光模塊SCP1 進(jìn)行觀察和拍照。

3.3 小鼠SCP3 蛋白和MLH1 的免疫熒光標(biāo)記

實(shí)驗(yàn)方法同節(jié)3.2，一抗使用抗小鼠SCP3 抗體（山羊來(lái)源）和抗小鼠MLH1 抗體（兔來(lái)源），二抗使用Rhodamine 標(biāo)記的抗山羊抗體和FITC 標(biāo)記的抗兔抗體。使用綠色熒光模塊對(duì)MLH1 進(jìn)行觀察和拍照，使用紅色熒光模塊對(duì)SCP3 進(jìn)行觀察和拍照。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 小鼠SCP3 蛋白和SCP1 蛋白的免疫熒光標(biāo)記

根據(jù)減數(shù)分裂前期I 各階段染色體聯(lián)會(huì)特點(diǎn)，在熒光顯微鏡下尋找細(xì)線(xiàn)期、偶線(xiàn)期、粗線(xiàn)期、雙線(xiàn)期和終變期的細(xì)胞，如圖1 所示。

4.2 小鼠SCP3 蛋白和MLH1 的免疫熒光標(biāo)記

染色體的同源重組現(xiàn)象發(fā)生在粗線(xiàn)期，在顯微鏡下尋找粗線(xiàn)期的細(xì)胞進(jìn)行觀察，如圖2 所示。

5 討論

5.1 同源染色體聯(lián)會(huì)與DNA 同源重組的重要性

圖1 減數(shù)分裂前期I 各階段聯(lián)會(huì)復(fù)合體的形態(tài)（100×）

圖2 減數(shù)分裂前期I 粗線(xiàn)期聯(lián)會(huì)復(fù)合體和重組節(jié)的形態(tài)（100×）

同源染色體聯(lián)會(huì)與重組是發(fā)生在減數(shù)分裂前期I的重要生理活動(dòng)，也是遺傳學(xué)教學(xué)中的重要知識(shí)點(diǎn)。聯(lián)會(huì)復(fù)合體能夠?yàn)槁?lián)會(huì)的發(fā)生和同源染色體交叉提供框架，是同源染色體聯(lián)會(huì)和基因重組的關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)[7]。聯(lián)會(huì)復(fù)合體的異常將導(dǎo)致聯(lián)會(huì)不能正常進(jìn)行，不能產(chǎn)生正常的配子。圍繞聯(lián)會(huì)復(fù)合體形態(tài)進(jìn)行的研究已經(jīng)廣泛應(yīng)用于精子發(fā)育異常、雄性不育癥機(jī)理研究和臨床診斷領(lǐng)域[8-9]。這些知識(shí)與生命科學(xué)類(lèi)及相關(guān)專(zhuān)業(yè)本科生未來(lái)的學(xué)習(xí)和科研緊密相關(guān)。目前，在大部分高校中，該知識(shí)點(diǎn)的教學(xué)僅在理論課層面展開(kāi)，并沒(méi)有實(shí)驗(yàn)課程與之匹配。在實(shí)驗(yàn)課程中開(kāi)設(shè)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，讓學(xué)生直觀地觀察到聯(lián)會(huì)復(fù)合體和重組節(jié)形態(tài)特點(diǎn)，可以幫助他們了解和掌握同源染色體聯(lián)會(huì)和DNA同源重組。

5.2 實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)

染色體展片是本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)難點(diǎn)，為了獲得較多的精母細(xì)胞，操作時(shí)就要盡量將曲細(xì)精管剪碎。此外，展片需要一定的時(shí)間，時(shí)間越長(zhǎng)細(xì)胞的分散度越好，同時(shí)要注意保濕，防止細(xì)胞懸液蒸發(fā)。實(shí)驗(yàn)采用了免疫熒光雙標(biāo)的方法，2 種抗體混合的比例需要通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定，避免出現(xiàn)2 種熒光亮度差距較大的問(wèn)題。

5.3 教學(xué)的組織安排

減數(shù)分裂同源染色體聯(lián)會(huì)與重組觀察實(shí)驗(yàn)主要包括3 部分內(nèi)容：“減數(shù)分裂染色體展片的制備”需要5～6 學(xué)時(shí)，“SCP3 和SCP1 的免疫熒光標(biāo)記”需要4～5學(xué)時(shí)，“SCP3 蛋白和MLH1 的免疫熒光標(biāo)記”需要4～5學(xué)時(shí)。在組織教學(xué)時(shí)，這3 部分可以作為3 個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目開(kāi)設(shè)，也可以將“減數(shù)分裂染色體展片的制備”同“SCP3 和SCP1 免疫熒光標(biāo)記”或“SCP3 和MLH1 免疫熒光標(biāo)記”進(jìn)行組合，作為一個(gè)8～10 學(xué)時(shí)的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，還可以將3 部分內(nèi)容組成一個(gè)14～16 學(xué)時(shí)的綜合性實(shí)驗(yàn)。

6 結(jié)語(yǔ)

在理工類(lèi)專(zhuān)業(yè)創(chuàng)新性科研人才培養(yǎng)的過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)教學(xué)發(fā)揮著非常重要的作用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的改革來(lái)助力創(chuàng)新性科研人才的培養(yǎng)也越來(lái)越受到大家的認(rèn)可[10-12]。將與科研前沿緊密相關(guān)的知識(shí)轉(zhuǎn)化為實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，使這些實(shí)驗(yàn)教學(xué)的教學(xué)內(nèi)容更加貼近科研實(shí)踐，提高學(xué)生對(duì)科學(xué)研究的興趣，為創(chuàng)新性人才培養(yǎng)模式探索提供思路。