楊 成，封肖穎，孫嵇成，龐月紅

(江南大學(xué) 食品學(xué)院 江蘇 無(wú)錫 214122)

多環(huán)芳烴(PAHs)是一類有機(jī)污染物，對(duì)人體具有潛在的致癌性和致畸性，持久性地廣泛存在于水、食物和土壤中，可以經(jīng)過(guò)呼吸道、消化道、皮膚等多種途徑進(jìn)入體內(nèi)，易在生物體內(nèi)蓄積[1-3]。1-羥基芘(1-OHP)是多環(huán)芳烴的主要代謝產(chǎn)物之一，因該物質(zhì)在人體尿液中能較好地反映PAHs的暴露情況，一直被作為研究PAHs暴露的生物標(biāo)記物[4-5]，其含量的測(cè)定具有十分重要的意義。有研究發(fā)現(xiàn)隨著宮頸病變程度的加重，人體尿中1-羥基芘濃度及高暴露率升高[6]。

1-羥基芘的檢測(cè)方法有高效液相色譜法[7]、液相色譜/氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法[8-10]、電噴霧萃取電離質(zhì)譜法[11]、光譜法等[12]，這些方法檢測(cè)靈敏，但所需的設(shè)備價(jià)格昂貴，對(duì)操作人員的要求嚴(yán)格。而電化學(xué)方法由于靈敏度高、成本低、速度快、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，在分析檢測(cè)中得到了廣泛關(guān)注[13-14]。

石墨烯是一種sp2軌道雜化的二維碳納米結(jié)構(gòu)，具有良好的導(dǎo)電性能和力學(xué)性能[15]。石墨烯的電子遷移率大，電阻率小，導(dǎo)電性能良好，將其作為修飾電極應(yīng)用于小分子的檢測(cè)受到越來(lái)越多的關(guān)注[16]。馬玲等[17]通過(guò)滴涂法將石墨烯溶液滴至玻碳電極表面，室溫下自然晾干，利用循環(huán)伏安法(CV)建立了維生素B12的檢測(cè)方法。Wang等[18-19]通過(guò)電還原氧化石墨烯修飾電極，在抗壞血酸(AA)存在下實(shí)現(xiàn)了多巴胺的檢測(cè)。Sharma等[20]在石墨烯上負(fù)載Pt納米粒子，增加了對(duì)有機(jī)小分子的電催化氧化能力。筆者課題組[21]采用蒽和喹啉單元中的Suzuki偶聯(lián)反應(yīng)合成了一種共軛聚合物聚-8-甲氧基-7-甲基-5-(10-蒽-9-基)喹諾酮(PMMAYQ)，并基于均相可控的{PMMAYQ-石墨烯}n多層膜研制了一種靈敏的1-羥基芘電化學(xué)傳感器。本文以氧化石墨烯和氯鉑酸混合液為前軀體，采用一步電沉積法制備了納米鉑/還原氧化石墨烯修飾電極(Pt/E-rGO/GCE)，并采用CV法研究了1-羥基芘在該修飾電極上的電化學(xué)行為，并利用差分脈沖伏安法(DPV)實(shí)現(xiàn)了對(duì)1-羥基芘的定量檢測(cè)(如圖1)。

圖1 Pt/E-rGO/GCE 制備過(guò)程及其原位富集傳感1-羥基芘示意圖Fig.1 Schematic diagram of Pt/E-rGO/GCE preparation and in situ enrichment sensing for 1-hydroxypyrene

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI660C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)；FE20K精密pH計(jì)(梅勒-托萊登斯特有限公司)；Centrifuge 5810R型臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)艾本德公司)；Milli-Q Integral Cabinet 3超純水系統(tǒng)(美國(guó)密里博公司)；超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。氧化石墨烯(南京先豐納米材料科技有限公司)；氯鉑酸(H2PtCl6，純度≥99.9%)，1-羥基芘(純度≥98%)，高氯酸鈉、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸、氯化鉀、甲醇、乙醇、醋酸、醋酸鈉(分析純)，上述試劑均購(gòu)于上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 納米鉑-石墨烯修飾電極的制備

用0.05 μm的氧化鋁在麂皮上將玻碳電極拋光至鏡面，用水沖洗后，再依次用硝酸-水(1∶3)溶液、乙醇溶液和水超聲清洗各1 min，氮?dú)獯蹈?，處理好的電極備用。稱取10 mg氧化石墨烯(GO)溶解于10 mL水中，超聲分散1 h，加入一定質(zhì)量H2PtCl6和H2SO4，配成1 mg/mL氧化石墨烯、1 mmol/L H2PtCl6和0.5 mol/L H2SO4的混合液，繼續(xù)超聲分散1 h，作為電沉積液。將處理好的玻碳電極插入上述電沉積液中，采用CV法掃描，掃描范圍為-1.4～0.6 V，掃描速率為50 mV/s，一步電沉積法制備得到納米鉑/還原氧化石墨烯(Pt/E-rGO)修飾電極。

1.3 樣品處理

收集匿名志愿者尿樣于棕色瓶中，在-20 ℃下避光保存。測(cè)試前，在室溫下解凍，搖勻，取10 mL樣品于50 mL錐形瓶中，加入20 μLβ-葡萄糖醛酸酶和5 mL pH 5.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，充分混合均勻后，37 ℃下恒溫酶解2 h，離心，吸取上清液，加入5 mL正己烷萃取2次，棄去上清液，合并下清液。氮?dú)獯蹈珊螅匦氯芙庥? mL PBS緩沖液中，備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 Pt/E-rGO材料的表征

圖3 不同電極在0.5 mol/L H2SO4中的循環(huán)伏安曲線Fig.3 CV curves of different electrodes in 0.5 mol/L H2SO4a：GCE；b：E-rGO/GCE；c：Pt/GCE；d：Pt/E-rGO/GCE

2.2 Pt/E-rGO/GCE的電化學(xué)行為

Pt/E-rGO/GCE在0.5 mol/L H2SO4溶液中的CV曲線如圖3所示，與裸GCE和E-rGO/GCE相比，Pt/E-rGO/GCE的CV曲線可觀察到明顯的峰，且峰形與Pt/GCE的相似，均分別在0.5 V和0.9～1.2 V處出現(xiàn)明顯的Pt的氧化還原特征峰，表明Pt已修飾至電極表面。

分別將裸GCE電極、E-rGO/GCE、Pt/E-rGO/GCE與Pt/GCE置于1 mmol/L 鐵氰化鉀/亞鐵氰化[Fe(CN)6]3-/4-(含0.2 mol/L KCl)溶液中，使用阻抗法及CV法對(duì)修飾電極的電化學(xué)性能進(jìn)行表征。

如圖4A所示，裸GCE、Pt/GCE、E-rGO/GCE與Pt/E-rGO/GCE的阻抗逐漸變大，表明在電極上修飾了納米鉑、石墨烯材料后，其電阻增大。而從[Fe(CN)6]3-/4-在電極表面的氧化還原反應(yīng)(圖4B)可以看出，裸GCE、Pt/GCE、E-rGO/GCE與Pt/E-rGO/GCE的峰電流值依次增大，表明Pt/E-rGO/GCE的氧化還原電流增強(qiáng)可能是由于電極比表面積增大所致。

2.3 1-羥基芘在Pt/E-rGO/GCE上的電化學(xué)性質(zhì)

采用CV法，在含200 nmol/L 1-羥基芘的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中，對(duì)裸GCE、E-rGO/GCE與Pt/E-rGO/GCE進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖5(a、b、c)所示，利用GCE對(duì)1-羥基芘進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，無(wú)明顯的氧化還原峰出現(xiàn)；利用E-rGO/GCE對(duì)1-羥基芘進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，氧化還原峰電流顯著增加，峰電位差縮小至35 mV；利用Pt/E-rGO/GCE對(duì)1-羥基芘進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，由于納米鉑和石墨烯的協(xié)同作用使得電極具有良好的催化活性與極大的電子傳導(dǎo)率，使1-羥基芘的氧化還原峰電流達(dá)到最大值，峰電位差縮小至64 mV。

圖5 3種不同電極在200 nmol/L 1-羥基芘中的CV曲線(a～c)及 Pt/E-rGO/GCE在PBS溶液中的CV曲線(d)Fig.5 CV curves of three different electrodes in 200 nmol/L 1-hydroxypyrene(a-c) and Pt/E-rGO/GCE in PBS solution(d)a：GCE；b：E-rGO/GCE；c：Pt/E-rGO/GCE

利用Pt/E-rGO/GCE進(jìn)一步考察了空白PBS的CV曲線。結(jié)果顯示，在空白PBS溶液中無(wú)氧化還原峰(圖5d)，而在200 nmol/L 1-羥基芘溶液中有明顯的氧化還原峰(圖5c)。此現(xiàn)象表明，將Pt/E-rGO/GCE用于1-羥基芘的檢測(cè)，可極大地提高檢測(cè)靈敏度。

2.4 掃描速率的影響

采用CV法，考察了掃描速率(10～100 mV/s)對(duì)1-羥基芘氧化還原峰電流的影響。結(jié)果顯示，隨著掃描速率的增加，1-羥基芘的氧化還原峰電流強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，且與掃描速率在10～100 mV/s范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程分別為：Ipc(μA)=0.270 0v+3.800(mV/s)(r2=0.980)，Ipa(μA)=-0.308 0v+2.881(mV/s)(r2=0.973)，表明1-羥基芘在Pt/E-rGO/GCE表面是一個(gè)吸附控制過(guò)程。

2.5 電解液pH值的影響

2.6 電沉積圈數(shù)的影響

在1-羥基芘的檢測(cè)過(guò)程中，1-羥基芘的還原峰電流與電極上電沉積Pt/E-rGO的圈數(shù)有關(guān)。利用Pt/E-rGO/GCE，通過(guò)差分脈沖伏安法對(duì)200 nmol/L的1-羥基芘進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果顯示，在3～5圈內(nèi)，隨著電沉積圈數(shù)的增大，1-羥基芘的還原峰電流逐漸增大，當(dāng)電沉積圈數(shù)大于5圈后，由于制得的Pt/E-rGO膜過(guò)厚，降低了電子傳導(dǎo)率，1-羥基芘的還原峰電流開(kāi)始下降。所以，選取5圈作為最佳電沉積圈數(shù)。

2.7 1-羥基芘的定量檢測(cè)

在上述優(yōu)化條件下，采用Pt/E-rGO/GCE修飾電極通過(guò)DPV法對(duì)不同濃度的1-羥基芘進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如圖7所示。隨著1-羥基芘濃度的增加，其在0.3 V電位下獲得的還原電流值逐漸增強(qiáng)，且在50～700 nmol/L范圍內(nèi)，1-羥基芘的濃度(c1-OHP,nmol/L)與其還原峰電流(ΔI,μA)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為ΔI(μA)= 0.185c1-OHP+19.821(nmol/L)，相關(guān)系數(shù)(r)為0.976，檢出限(S/N=3)為12.1 nmol/L。

圖6 pH值對(duì)1-羥基芘氧化還原峰電流的影響Fig.6 Influence of pH value on peak current of 1-hydroxypyrene raluepH value(a-g):2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0;insert:relationship between apparent

圖7 不同濃度1-羥基芘在Pt/E-rGO/GCE上的DPV圖Fig.7 DPV curves of different concentrations of 1-hydroxypyrene on Pt/E-rGO/GCEconcentration of 1-hydroxypyrene(a-k):0，50，100，150，200，250，300，400，500，600，700 nmol/L；insert:relationship between DPV response current and 1-OHP concentration

圖8 Pt/E-rGO/GCE在1-羥基芘(a)和UA+1-羥基芘(b)中的循環(huán)伏安曲線Fig.8 CV curves of Pt/E-rGO/GCE in 1-hydroxypyrene(a) and UA+1-hydroxypyrene (b)

2.8 Pt/E-rGO/GCE的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性與選擇性

采用5支Pt/E-rGO/GCE在含500 nmol/L 1-羥基芘的PBS溶液中連續(xù)測(cè)定，測(cè)得5支電極還原峰電流響應(yīng)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.4%。將修飾電極于室溫下放置10 d后在相同條件下測(cè)試，其響應(yīng)值為初始值的90.6%。表明該修飾電極對(duì)1-羥基芘的檢測(cè)具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

2.9 尿液樣品中1-羥基芘的測(cè)定

將健康志愿者尿樣按照“1.3”方法進(jìn)行預(yù)處理后，用本文制備的電化學(xué)傳感器進(jìn)行測(cè)定，尿液中未檢出1-羥基芘，判定為陰性。在此尿液樣品中加入3個(gè)濃度水平(75、300、500 nmol/L)的1-羥基芘，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定5次。結(jié)果表明，尿樣中1-羥基芘在低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平下的平均加標(biāo)回收率分別為99.7%、104%、108%，RSD分別為3.4%、4.3%、3.2%。表明本文構(gòu)建的電化學(xué)傳感器可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

3 結(jié) 論

本文采用一步電沉積法制備了納米鉑還原氧化石墨烯修飾電極。由于納米鉑和還原氧化石墨烯的協(xié)同作用增強(qiáng)了電極的導(dǎo)電性，極大地提高了電極的靈敏度，因而較普通玻碳電極和還原氧化石墨烯修飾電極的性能更為優(yōu)越。結(jié)合差分脈沖伏安法原位富集1-羥基芘，建立了電化學(xué)檢測(cè)1-羥基芘的分析方法，檢出限為12.1 nmol/L。該方法還具有良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性以及抗干擾性，已成功應(yīng)用于人體尿液中1-羥基芘的檢測(cè)。