陳 超，羅輝泰，張秋炎，楊運(yùn)云，向章敏，劉舒芹

(廣東省科學(xué)院 廣東省測(cè)試分析研究所(中國廣州分析測(cè)試中心) 廣東省原位電離質(zhì)譜分析工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070)

百草枯(1,1′-二甲基-4,4′-聯(lián)吡啶二氯鹽，Paraquat)是一種聯(lián)吡啶類陽離子季銨鹽，具有高水溶性和低揮發(fā)性，是在全球范圍內(nèi)被廣泛使用的農(nóng)業(yè)非選擇性高效除草劑之一[1]。百草枯對(duì)人和動(dòng)物具有極高的毒性，易通過皮膚、呼吸道和消化道被吸收，會(huì)對(duì)肝、肺、腎、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)造成不可逆的嚴(yán)重?fù)p害[2]，且目前尚無特效解毒劑。自2016年起，我國已禁止生產(chǎn)、銷售和使用高劑量的百草枯，但每年仍有百草枯中毒死亡的案例發(fā)生。有研究[3-4]表明百草枯在血液和尿液中的濃度和中毒時(shí)間的相關(guān)性是評(píng)價(jià)患者預(yù)后診斷的重要指標(biāo)，因此，亟待建立快速準(zhǔn)確測(cè)定百草枯在中毒患者體內(nèi)濃度的分析方法。

近年來，血液和尿液中百草枯含量測(cè)定常用的方法主要有分光光度法[5-6]、氣相色譜法[7](GC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[8]、液相色譜法(HPLC)[9]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[10-11]和毛細(xì)管電泳法(CE)[12]等，但這些方法存在諸如耗時(shí)長，易受基質(zhì)效應(yīng)影響，樣品預(yù)處理過程復(fù)雜等局限性。相比之下，基質(zhì)輔助激光解吸電離-傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜法[13-14](MALDI-FTICR-MS)具有超高分辨率、靈敏度與精確度高、樣品用量少、制備方便、耗時(shí)短、易操作、耐鹽度好等優(yōu)點(diǎn)，適用于復(fù)雜生物樣品中痕量成分的直接快速測(cè)定?；诖?，本研究建立了一種利用MALDI-FTICR-MS測(cè)定全血及尿液中百草枯的方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)微量生物樣本中百草枯的快速定量分析，方法前處理簡單快速，試劑消耗少，可滿足醫(yī)院臨床監(jiān)測(cè)及司法鑒定需求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

配有基質(zhì)輔助激光解吸電離源的Solarix XR 7.0 T傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(MALDI-FTICR-MS，德國Bruker公司)，配Smartbeam Ⅱ型固態(tài)激光器，最大能量300 μJ，頻率在0～1 kHz內(nèi)可調(diào)，波長為355 nm；DataAnalysis 5.0數(shù)據(jù)處理軟件(德國Bruker公司)；BSA224S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；CT15RE型離心機(jī)(日立工機(jī)株式會(huì)社)；JP-060S型超聲波清洗機(jī)(深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司)；VORTEX 1型旋渦混合器(德國IKA公司)。

百草枯和百草枯-D8標(biāo)準(zhǔn)品(純度分別為82.4%和95.9%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)；2,5-二羥基苯甲酸(2,5-DHB，德國Bruker 公司)；α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、芥子酸(SA)(美國Sigma-Aldrich公司)；乙腈(色譜純，美國Honeywell公司)；甲酸(LC-MS級(jí)，美國Thermo Fisher Scientific公司)；三氟乙酸鈉校準(zhǔn)溶液(NaTFA，美國Sigma-Aldrich公司)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備；實(shí)際樣品均為客戶委托送檢樣品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取適量(精確至0.000 1 g)百草枯和百草枯-D8標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容，分別配成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于塑料瓶中-20 ℃冷凍保存。精密移取百草枯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用含1%甲酸的乙腈溶液稀釋成質(zhì)量濃度為5、10、25、50、100、500、1 000、2 000 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；百草枯-D8儲(chǔ)備液用含1%甲酸的乙腈溶液稀釋成質(zhì)量濃度為100 μg/L的內(nèi)標(biāo)工作溶液。

1.3 樣品制備

1.3.1 提 取取10 μL全血或尿液置于1.5 mL EP(艾本德，Eppendorf)離心管中，其中全血加入25 μL內(nèi)標(biāo)工作溶液(100 μg/L)和25 μL含1%甲酸的乙腈溶液，尿液中加入20 μL內(nèi)標(biāo)工作溶液(100 μg/L)和20 μL含1%甲酸的乙腈溶液，然后各超聲2 min，再渦旋1 min，最后在室溫下以10 000 r/min高速離心10 min，取上清液，備用。

1.3.2 點(diǎn) 樣精密移取10 μL上清液與10 μL 2,5-DHB(10 g/L，用30%乙腈水溶液配制)溶液等比例混勻，取3 μL混合液點(diǎn)樣于MALDI靶板上，待基質(zhì)自然晾干形成均勻結(jié)晶層后方可進(jìn)樣分析。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別以10 μL空白全血、空白尿液和純水為基質(zhì)繪制3條標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制方法：向空白全血中加25 μL內(nèi)標(biāo)(100 μg/L)和25 μL系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，尿液和純水中分別加20 μL內(nèi)標(biāo)(100 μg/L)和20 μL系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，然后超聲2 min，再渦旋1 min，最后在室溫下以10 000 r/min高速離心10 min。采用“1.3.2”點(diǎn)樣方法進(jìn)樣分析。

1.5 質(zhì)譜條件

在正離子模式下采用MALDI源，質(zhì)量采集范圍為m/z50～300，采樣大小為2 M(兆)，累加次數(shù)為8；激光能量為30%，頻率100 Hz，激光點(diǎn)數(shù)為100 Shots，光斑為Medium，激光路徑為Random。數(shù)據(jù)采集前，在ESI正/負(fù)離子源模式下用0.01 g/L三氟乙酸鈉溶液(用50%乙腈水溶液配制)進(jìn)行儀器校準(zhǔn)；數(shù)據(jù)采集過程中鎖定內(nèi)標(biāo)離子m/z194.165 36進(jìn)行實(shí)時(shí)校正，以保證數(shù)據(jù)采集中質(zhì)量軸的準(zhǔn)確性。定性離子對(duì)為m/z186.115 15→171.091 67，定量離子為m/z186.115 15，并采用內(nèi)標(biāo)法定量分析(以定量離子峰m/z186.115 15與內(nèi)標(biāo)離子峰m/z194.165 36對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)度比值計(jì)算)。

2 結(jié)果與討論

2.1 MALDI基質(zhì)的選擇

按“1.3”方法進(jìn)行樣品提取及點(diǎn)樣，分別在50 μL空白全血、空白尿液和純水中加入100 μL百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/L)和100 μL含1%甲酸的乙腈溶液，考察不同樣品與2,5-DHB、CHCA和SA(濃度均為10 g/L) 3種常用的MALDI基質(zhì)[15]混合點(diǎn)樣后的分析結(jié)果。結(jié)果顯示：在相同加標(biāo)濃度下，全血、尿液和純水樣品用2,5-DHB為基質(zhì)輔助電離得到的百草枯響應(yīng)強(qiáng)度最高，故選擇2,5-DHB為MALDI基質(zhì)輔助百草枯的電離。

2.2 提取條件的優(yōu)化

由于全血和尿液中均含有大量蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽，若直接進(jìn)質(zhì)譜會(huì)影響百草枯的離子化效率，因此需通過前處理去除干擾成分。本研究采用液液萃取方式提取全血和尿液中的百草枯，方法簡單快速，節(jié)省前處理時(shí)間。文獻(xiàn)報(bào)道采用液液萃取方式提取血液和尿液中百草枯的優(yōu)選溶劑包括純乙腈[10,16]、含1%甲酸的乙腈溶液[9]和80%乙腈水溶液[17]，因此實(shí)驗(yàn)考察了這3種萃取溶劑對(duì)全血和尿液中百草枯(空白樣品加標(biāo)濃度為200 μg/L)的提取效率。結(jié)果顯示，采用含1%甲酸的乙腈溶液對(duì)全血和尿液中百草枯的提取效率相對(duì)較高，且由于百草枯在酸性和中性溶液中相對(duì)穩(wěn)定，而在堿性溶液中易分解[18]，考慮到部分尿液可能為堿性，因此選擇含1%甲酸的乙腈溶液為樣品提取溶劑，以使樣品的穩(wěn)定性更好。

2.3 MALDI條件的優(yōu)化

MALDI源可優(yōu)化的條件通常有累加次數(shù)、激光能量、激光頻率、激光點(diǎn)數(shù)、光斑大小，其中累加次數(shù)對(duì)百草枯離子峰強(qiáng)度的影響最大。一般以2n增加，8次以內(nèi)累加次數(shù)越多，峰強(qiáng)度越大，但超過8次后峰強(qiáng)度無明顯增加，因此選擇累加次數(shù)為8次，即激光在手動(dòng)選取的中心點(diǎn)附近按照一定規(guī)律選取8個(gè)位置完成一次采集。增加激光能量、激光頻率、激光點(diǎn)數(shù)均會(huì)增強(qiáng)離子流且獲得高信噪比的質(zhì)譜圖，但離子流太強(qiáng)，過剩的離子在和諧阱中將受電荷排斥導(dǎo)致質(zhì)量軸偏移[19]，使最終得到的質(zhì)譜峰分叉而影響定性和定量分析。激光能量、激光頻率、激光點(diǎn)數(shù)和光斑大小分別通過單因素優(yōu)化，比較對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)度和穩(wěn)定性，最終確定上述參數(shù)優(yōu)化后分別為30%、100 Hz、100 Shots和Medium光斑模式。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 專屬性與基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)分別取3份空白全血和尿液按照“1.3”方法將其中內(nèi)標(biāo)溶液換成含1%甲酸的乙腈溶液進(jìn)行前處理和點(diǎn)樣，在優(yōu)化條件下測(cè)定，結(jié)果見圖1。由圖可見，空白全血和尿液在百草枯(m/z186.115 15)和內(nèi)標(biāo)(m/z194.165 36)標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的離子峰位置并無相應(yīng)的離子峰出現(xiàn)，雖然附近有其他峰，但FTICR-MS具有超高分辨率，可以很好的將其分開，因此專屬性符合要求。

圖1 百草枯和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)、空白全血(B)及空白尿液(C)的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrograms of paraguat and internal standard solution(A),blank whole blood(B) and blank urine(C)

生物樣本在進(jìn)行質(zhì)譜分析時(shí)，由于本底成分復(fù)雜，會(huì)對(duì)待測(cè)組分的離子化產(chǎn)生影響，產(chǎn)生特定的離子增強(qiáng)或抑制作用，這種影響被稱為基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect，ME)[20]。本實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值來評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，其計(jì)算公式為ME=Ka/Kb，其中Ka為樣品基質(zhì)校準(zhǔn)曲線的斜率，Kb為溶劑校準(zhǔn)曲線的斜率；ME為100%時(shí)表示無基質(zhì)效應(yīng)，80%～120%時(shí)為弱基質(zhì)效應(yīng)，50%～80%或120%～150%時(shí)為中等程度基質(zhì)效應(yīng)，ME<50%或ME>150%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[20]。由表1可見，在全血和尿液的ME值分別為101%和105%，表明此兩種樣本分析痕量百草枯時(shí)會(huì)產(chǎn)生一定的基質(zhì)效應(yīng)，但影響不大。而比較同一百草枯加標(biāo)濃度下待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰強(qiáng)度和比值，發(fā)現(xiàn)全血和尿液對(duì)待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)同時(shí)產(chǎn)生明顯的離子抑制作用，由于本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)法定量，在定量過程中加入內(nèi)標(biāo)校正后可消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，因此可直接采用純?nèi)軇┡渲茦?biāo)準(zhǔn)曲線來進(jìn)行實(shí)際樣品的測(cè)定。

2.4.2 線性關(guān)系、檢出限與定量下限以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x，μg/L)，對(duì)應(yīng)的待測(cè)物定量離子與內(nèi)標(biāo)離子峰強(qiáng)度的比值為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，全血、尿液、水3種基質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液在10～5 000 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r)為0.995 5～0.999 2(表1)。以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算得全血、尿液和純水中百草枯的檢出限(LOD)分別為3.0、1.5、0.6 μg/L，定量下限(LOQ，S/N=10)分別為10、5.0、2.0 μg/L。

表1 百草枯在全血、尿液及水中的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)、檢出限及定量下限Table 1 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients,matrix effects,average recoveries,RSDs,LODs and LOQs of paraquat in whole blood,urine and water

2.4.3 準(zhǔn)確度與精密度分別取空白全血和尿液，進(jìn)行低、中、高3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，按“1.3”方法進(jìn)行樣品制備，每個(gè)濃度水平平行制備6個(gè)樣品，在優(yōu)化條件下測(cè)定，計(jì)算方法的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示，百草枯在全血和尿液2種生物樣品中3個(gè)加標(biāo)濃度下的回收率為85.2%～110%，RSD為0.40～7.3%(表1)，表明方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，可滿足檢測(cè)要求。

2.4.4 穩(wěn)定性評(píng)價(jià)采用空白樣品加標(biāo)分別考察了全血和尿液中百草枯在室溫下24 h內(nèi)、反復(fù)凍融3次(-20 ℃)、在-20 ℃儲(chǔ)存條件下7 d和30 d的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，每個(gè)條件平行3次。結(jié)果顯示，百草枯在全血和尿液中的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5～7.7%，回收率為90.1%～106%，說明本研究所建立分析方法的穩(wěn)定性符合要求，樣品在-20 ℃儲(chǔ)存條件下30 d內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 與其他方法的比較將本方法與已報(bào)道的生物樣本中百草枯的檢測(cè)方法進(jìn)行比較(表2)，由表中數(shù)據(jù)可見，本方法所需樣品量和溶劑量更少，且百草枯的檢出限更低。此外，本法采用液液萃取法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，只需一步萃取即可上樣分析，分析時(shí)間僅十幾秒，顯著縮短了檢測(cè)時(shí)間，可滿足臨床及司法鑒定中百草枯中毒快速檢測(cè)的需求。

表2 與其他文獻(xiàn)報(bào)道的生物樣本中百草枯檢測(cè)方法的比較Table 2 Comparison with the reported analytical techniques for the determination of paraquat in biological samples

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法對(duì)3份來自醫(yī)院百草枯中毒病人的全血和尿液進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，3份病人全血中分別檢出百草枯含量為0.794、5.45、0.049 4 μg/L，RSD分別為5.7%、8.0%、5.4%；對(duì)應(yīng)病人的尿液中百草枯檢出含量分別為2.58、153、0.818 μg/L，RSD分別為1.5%、1.4%、3.7%。3份病人尿液中的百草枯含量明顯高于血液，表明病人中毒后，大量百草枯可通過尿液排出體外。其中1份病人的全血和尿液樣品的質(zhì)譜圖見圖2，該病人全血及尿液中所檢出的百草枯含量分別為0.049 4、0.818 μg/L。

3 結(jié) 論

本研究建立了一種利用MALDI-FTICR-MS測(cè)定全血及尿液中百草枯的方法，以含1%甲酸的乙腈溶液為提取溶劑，采用液液萃取法從生物樣品中提取百草枯，提取液與2,5-DHB(10 g/L)基質(zhì)混合后即可點(diǎn)樣分析。該方法具有樣品和溶劑用量少、操作簡單、分析速度快和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可滿足臨床及司法鑒定中百草枯中毒快速檢測(cè)的需求。