左軍鳳，賀針華，2，熊馬劍，朱碧君*

(1.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330029；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004)

熒光增白劑的檢測(cè)方法主要有紫外燈照射觀測(cè)法[9-10]、熒光分光光度法[11-12]、液相色譜法[13-14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15]。紫外燈照射觀測(cè)法只能定性分析熒光增白劑，不能確定其種類(lèi)和含量。液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法均可用于熒光增白劑的定性和定量檢測(cè)[16]。其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法雖定性準(zhǔn)確、靈敏度高，但設(shè)備價(jià)格昂貴，維護(hù)和使用成本很高[17]。與傳統(tǒng)的高效液相色譜法相比，超高效液相色譜法擁有更快的分析速度、更高的靈敏度和更好的分離度，可縮短分析時(shí)間，節(jié)約溶劑，降低分析成本。為了研究藥用復(fù)合膜中水溶性熒光增白劑，本文采用超高效液相色譜法建立了上述7種水溶性熒光增白劑的檢測(cè)方法。方法簡(jiǎn)便、快速，適用于藥用復(fù)合膜樣品中水溶性熒光增白劑的分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

LC-30AD 超快速液相色譜儀，配PDA檢測(cè)器(日本島津公司)；MS-105電子天平(梅特勒-托利多控股有限公司)；KQ-500DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

熒光增白劑均購(gòu)自深圳市瑞吉特生物科技有限公司，7種水溶性熒光增白劑試劑分別為：5-{4，4，-雙[[4-[雙(2-羥基乙基)氨基]-6-(4-磺酸鈉苯胺)-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]苯乙烯-2，2，-二磺酸鈉}(FWA220，批號(hào)：180106)、2，2，-(1，2-乙二基)雙[5-[[4-[雙(2-羥乙基)氨基]-6-[(3-二氧苯基)氨基]-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]苯磺酸鈉](FWA24，批號(hào)：181204)、4，4，-雙(4，4，-羥乙基氨基-6-苯胺基-1，3，5-三嗪-2-氨基)二苯乙烯-2，2，-二磺酸鈉(FWA113，批號(hào)：190320)、2，2，-[1，2-乙二基雙[(3-磺基-1，4-亞苯基)亞氨基[6-[雙(2-羥乙基)氨基]-1，3，5-三嗪-4，2-二基]亞氨基]]雙(1，4-苯二磺酸)六鈉鹽(FWA264，批號(hào)：190204)、4，4，-雙[(4-苯胺基-6-甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2，2，二磺酸二鈉(FWA134，批號(hào)：181125)、2，2，-(1，2-乙二基)雙[5-[[4-(二乙氨基)-6-[(2，5-二磺苯基)氨基]-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]苯磺酸]六鈉鹽(FWA357，批號(hào)：190215)、4，4，-雙[(4-苯胺基-6-嗎啉基-1，3，5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2，2，-二磺酸二鈉鹽(FWA71，批號(hào)：181112)。甲醇、乙腈(色譜純，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司)。其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

聚酯/鋁/聚乙烯藥用復(fù)合膜(PET/Al/PE)、聚酯/鋁/聚丙烯藥用復(fù)合膜(PET/Al/PP)、紙/鋁/聚乙烯藥用復(fù)合膜(紙/Al/PE)、玻璃紙/鋁/聚乙烯藥用復(fù)合膜(PT/Al/PE)、鋁/聚乙烯藥用復(fù)合膜(Al/PE)、聚丙烯/鋁/聚乙烯藥用復(fù)合膜(PP/Al/PE)、聚酯/鍍鋁聚酯/聚乙烯藥用復(fù)合膜(PET/VMPET/PE)、雙向拉伸聚丙烯/真空鍍鋁流延聚丙烯藥用復(fù)合膜(BOPP/VMCPP)、聚酯/聚乙烯藥用復(fù)合膜(PET/PE)9個(gè)品種共191批藥用復(fù)合膜樣品以及33批聚酯原料膜、28批聚乙烯原料膜、7批聚丙烯原料膜、5批紙?jiān)蠘悠罚瑏?lái)源于國(guó)內(nèi)110個(gè)生產(chǎn)廠家。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱(chēng)取FWA220、FWA264、FWA357各0.08 g(精確至0.1 mg)，F(xiàn)WA24、FWA113、FWA134、FWA71各0.02 g(精確至0.1 mg)，分別置于50 mL棕色容量瓶中，加入40%乙腈水溶液(pH 11.0)溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為1 600 μg/mL和400 μg/mL的單標(biāo)母液。分別精密移取單標(biāo)母液各10 mL于100 mL棕色容量瓶中，加40%乙腈水溶液稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為160 μg/mL和40 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用40%乙腈水逐級(jí)稀釋并定容，配制系列標(biāo)準(zhǔn)使用液，其中FWA220、FWA264、FWA357的質(zhì)量濃度梯度分別為160、80、40、10、8、4 μg/mL，F(xiàn)WA24、FWA113、FWA134、FWA71的質(zhì)量濃度梯度分別為40、20、10、2.5、2、1 μg/mL,于冰箱中保存。

1.3 樣品預(yù)處理

取藥用復(fù)合膜樣品，剪成約0.5 cm×0.5 cm的碎片，混勻后取約1 g，精密稱(chēng)定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入10 mL 40%乙腈水溶液(三乙胺調(diào)至pH 11.0)，50 ℃超聲水浴35 min后，用0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。

1.4 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相A為乙腈-甲醇混合溶液(2∶3，體積比)，流動(dòng)相B為含10 mmo/L四丁基溴化銨(TBA)的甲醇-水溶液(5∶95,體積比)，流動(dòng)相B經(jīng)三乙胺調(diào)至pH 8.0后梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?～1 min，55%A；1～10 min，55%～50% A；10～20 min，50%～45%A；20～35 min，45%～40%A；35～50 min，40%～55%A；流速為0.2 mL/min；柱溫為40 ℃；二極管檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm；進(jìn)樣體積為10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品預(yù)處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取方式的選擇采用陽(yáng)性樣品比較了熱水提取、振蕩提取、室溫超聲提取和加熱超聲提取4種提取方法對(duì)熒光增白劑(以FWA220和FWA113為例)提取率的影響。結(jié)果表明樣品中含有的FWA220和FWA113采用加熱超聲提取法時(shí)提取量最大，提取效果最好，熱水提取法次之，室溫超聲提取法更差，而振蕩提取法最差，故本實(shí)驗(yàn)選擇加熱超聲提取法作為最佳提取方式。

2.1.2 提取試劑的選擇考察了不同提取試劑的影響?？紤]到三乙胺既可調(diào)節(jié)pH值，又可起到掃尾劑的作用，本實(shí)驗(yàn)選擇三乙胺調(diào)節(jié)提取試劑的pH值。參考王天嬌等[14]在測(cè)定紙質(zhì)食品包裝材料中的樣品處理方法，調(diào)節(jié)提取試劑至pH 11.0，并使用陰性樣品加標(biāo)，分別考察了提取試劑為20%、30%、40%、50%、60%乙腈水溶液以及50%甲醇、乙醇、丙酮水溶液時(shí)，7種水溶性熒光增白劑的回收率。結(jié)果表明，當(dāng)提取試劑為40%乙腈水溶液時(shí)，7種水溶性熒光增白劑的回收率為70.0%～105%，優(yōu)于其他提取試劑。因此，實(shí)驗(yàn)選擇pH 11.0的40%的乙腈水溶液作為最佳提取試劑。

2.1.3 提取溫度的選擇使用陰性樣品加標(biāo)，分別在室溫、30 ℃、35 ℃、40 ℃、50 ℃下進(jìn)行超聲提取，計(jì)算回收率，以考察提取溫度的影響。結(jié)果表明，在50 ℃加熱超聲下，7種水溶性熒光增白劑的回收率為80.0%～101%，優(yōu)于其他提取溫度。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇50 ℃進(jìn)行加熱超聲。

2.1.4 提取時(shí)間的選擇使用陰性樣品加標(biāo)，50 ℃加熱超聲情況下，考察了提取時(shí)間分別為1、5、10、25、35、45 min時(shí)，7種水溶性熒光增白劑的回收率。結(jié)果表明，提取時(shí)間為35 min時(shí)，7種水溶性熒光增白劑的回收率為80.0%～101%，優(yōu)于其他提取時(shí)間。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇超聲提取35 min。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇為了使分離效果達(dá)到最佳，考察了ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)、Inertsil ODS-3柱(100 mm×2.1 mm，2 μm)、CAPCELL PAK C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、XDB-C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)、Eclipse XDB-C18柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)、ACQUITY UPLC Amide柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)6種色譜柱的分離效果。結(jié)果表明，ACQUITY UPLC BEH C18柱可將7種熒光增白劑分離完全，而其余色譜柱無(wú)法將各組分分離完全。故選擇ACQUITY UPLC BEH C18柱進(jìn)行分離。

2.2.2 柱溫的選擇分別考察了不同溫度(25、30、35、40 ℃)對(duì)分離效果的影響。結(jié)果表明，柱溫為40 ℃時(shí)分離效果最好。因此，實(shí)驗(yàn)選擇最佳柱溫為40 ℃。

2.2.3 有機(jī)相的洗脫在同樣的梯度洗脫條件和離子對(duì)試劑濃度下，對(duì)比了乙腈與甲醇為有機(jī)相時(shí)對(duì)7種熒光增白劑洗脫能力的差異，結(jié)果表明，分別使用乙腈和甲醇時(shí)，7種熒光增白劑的分離效果均不佳。基于該結(jié)果，進(jìn)一步考察了不同比例乙腈-甲醇混合溶劑對(duì)目標(biāo)物的洗脫作用。結(jié)果表明，乙腈-甲醇體積比為1∶1時(shí)，分離效果不理想；而體積比為2∶3時(shí)，7種熒光增白劑的分離度大于1.5。因此，實(shí)驗(yàn)確定乙腈-甲醇(2∶3)為最佳有機(jī)洗脫相。

2.2.4 TBA濃度的影響采用乙腈-甲醇(2∶3)為流動(dòng)相A，pH 8.0的甲醇-水(5∶95)溶液為流動(dòng)相B，考察了流動(dòng)相B中加入TBA濃度分別為5、10、25 mmol/L時(shí)熒光增白劑的分離情況，結(jié)果表明濃度為5 mmol/L時(shí)，分離效果不好，而濃度為25 mmol/L時(shí)雖分離效果最好，但FWA71的響應(yīng)值不高，且該TBA濃度對(duì)柱子的損害較大。因此，實(shí)驗(yàn)選擇TBA的最佳濃度為10 mmo/L。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)精密吸取“1.2”配制的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和經(jīng)“1.3”樣品預(yù)處理得到的供試品(紙/鋁/聚乙烯藥用復(fù)合膜)溶液各10 μL，并以乙腈和甲醇為空白對(duì)照，按“1.4”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖可知，在該色譜條件下，7種水溶性熒光增白劑能達(dá)到有效的分離，理論塔板數(shù)均超過(guò)3 000，所有色譜峰的分離度均大于1.5，且空白溶劑無(wú)干擾，供試品溶液色譜峰的出峰時(shí)間和混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液一致。

2.3.2 線(xiàn)性關(guān)系考察按照“1.2”方法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液，按“1.4”色譜條件進(jìn)行分析，進(jìn)樣體積為10 μL，以峰面積(x)為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(y，μg/mL)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算7種水溶性熒光增白劑的線(xiàn)性方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表1所示。7種水溶性熒光增白劑在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)為0.998 6～0.999 7。

表1 7種水溶性熒光增白劑的回歸方程、線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限(LOD)及定量下限(LOQ)Table 1 Regression equations,linear ranges,correlation coefficients(r), limits of detection(LOD) and limits of quantitation(LOQ) of 7 water-soluble fluorescent whitening agents

2.3.3 定量下限與檢出限取“1.2”混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，倍比稀釋?zhuān)础?.4”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比10 ∶1、3 ∶1 分別計(jì)算檢出限(LOD)、定量下限(LOQ)，得到LOD為0.17～1.29 μg/mL，LOQ為0.55～3.85 μg/mL(見(jiàn)表1)。表明方法具有較好的靈敏度。

2.3.4 精密度試驗(yàn)精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10 μL，按“1.4”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果測(cè)得7種熒光增白劑的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=6)分別為0.87%、0.55%、0.62%、0.76%、0.47%、1.1%、1.8%。表明儀器的精密度較好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)取一批藥用復(fù)合膜樣品約1 g，平行6份，精密稱(chēng)定，按“1.3”方法制備供試品溶液，“1.4”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果檢出FWA220和FWA113，其余熒光增白劑未檢出。FWA220和FWA113的平均含量分別為63.550 3、116.013 μg/g，RSD(n=6)分別為2.2%、3.2%。表明該方法的重現(xiàn)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)取與“2.3.5”同一批藥用復(fù)合膜樣品1份，稱(chēng)量1 g左右，加入約相當(dāng)于藥用復(fù)合膜含量100%的標(biāo)準(zhǔn)溶液1份，按“1.3”方法制備供試品溶液，“1.4”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，在0、2、6、10、14、18、20、24 h分別進(jìn)樣1次，連續(xù)進(jìn)樣8次，計(jì)算平均回收率。結(jié)果表明，7種熒光增白劑的RSD值分別為2.6%、4.3%、4.2%、3.2%、4.2%、2.7%、1.4%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 加標(biāo)回收率試驗(yàn)取與“2.3.5”同一批藥用復(fù)合膜樣品約1 g，共9份，精密稱(chēng)定，加入約相當(dāng)于藥用復(fù)合膜含量80%、100%、120%的標(biāo)準(zhǔn)溶液各3份，按“1.3”方法制備加標(biāo)供試品溶液，“1.4”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加標(biāo)回收率。結(jié)果見(jiàn)表2，7種水溶性熒光增白劑在3種加標(biāo)濃度下的平均回收率為83.2%～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0%～9.7%。方法的準(zhǔn)確度和精密度均能滿(mǎn)足測(cè)定的要求。

表2 7種水溶性熒光增白劑的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)Table 2 Spiked recoveries and relative standard deviations(RSD) of 7 water-soluble fluorescent whitening agents

(續(xù)表2)

表3 樣品的測(cè)定結(jié)果(μg/g)Table 3 Determination results of samples(μg/g)

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用所建立的方法對(duì)來(lái)源于110個(gè)生產(chǎn)廠家的9個(gè)復(fù)合膜品種共191批次藥用復(fù)合膜樣品和73批次原輔材料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，有6批藥用復(fù)合膜樣品檢出FWA220、FWA113，有3批藥用復(fù)合膜樣品只檢出FWA220，其余的復(fù)合膜樣品均未檢出熒光增白劑，2批紙?jiān)蠙z出FWA220和FWA113，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 結(jié) 論

本文建立了超高效液相色譜同時(shí)測(cè)定藥用復(fù)合膜中7種水溶性熒光增白劑的方法。該方法具有前處理簡(jiǎn)單、定量準(zhǔn)確和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，其重現(xiàn)性和線(xiàn)性關(guān)系均能滿(mǎn)足定量分析要求。方法已成功用于藥用復(fù)合膜樣品中7種水溶性熒光增白劑的常規(guī)分析。由于藥用復(fù)合膜用于藥品包裝，應(yīng)用廣泛，直接影響患者的用藥安全，此次檢測(cè)結(jié)果表明，仍有少量的藥用復(fù)合膜中檢出熒光增白劑，應(yīng)加強(qiáng)熒光增白劑的檢驗(yàn)監(jiān)管工作，本文所提供的方法可借鑒使用。