郭常川，楊書娟，劉 琦，王維劍，文松松，牛 沖，徐玉文

(山東省食品藥品檢驗研究院 國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室 山東省仿制藥一致性評價工程技術(shù)研究中心，山東 濟南 250101)

N-亞硝基二甲胺(N-nitrosodimethylamine，NDMA)又名N-二甲基亞硝胺，具有很強的致癌、致畸和致突變毒性，在ICH M7指南中明確說明該化合物具有強致癌性[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)公布的致癌物清單，NDMA屬于2A類致癌物質(zhì)[2]。自2018年以來，國內(nèi)外多家藥企涉及了纈沙坦、雷尼替丁等藥品中NDMA污染事件，甚至啟動了全球召回程序。2020年4月1日，美國食品藥品管理局(FDA)發(fā)布公告要求制藥商立即撤回所有雷尼替丁藥物，涉及處方藥和非處方藥，這是全球針對雷尼替丁NDMA污染調(diào)查的最新重磅舉措。法莫替丁化學結(jié)構(gòu)中具有與雷尼替丁類似的遺傳毒性、致癌性警示基團，因此很有必要對法莫替丁中的NDMA含量進行調(diào)查。

2020年5月8日，中國國家藥品監(jiān)督管理局(NMPA)發(fā)布了《化學藥物中亞硝胺類雜質(zhì)研究技術(shù)指導原則(試行)》[3]，分析了藥品中亞硝胺類雜質(zhì)引入的原因，并規(guī)定了亞硝胺類雜質(zhì)的限度控制。目前，NDMA 的檢測方法主要為高效液相色譜法(HPLC)[4]、HPLC-化學發(fā)光檢測法[5]、表面增強拉曼散射法(SERS)[6]、分子印跡聚合物電化學檢測法[7]、分子印跡聚合物液質(zhì)聯(lián)用檢測法[8]、超臨界流體色譜法[9]、二維離子色譜法[10]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[11-12]、氣相色譜-熱能分析法[13]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[13-15]等。但這些方法主要應用于食品(飲用水、水產(chǎn)品、肉制品等)、化妝品和煙草行業(yè)，而藥品中NDMA 檢測的研究極少，目前僅有測定纈沙坦、厄貝沙坦中NDMA的文獻報道[16-18]，但對雷尼替丁、法莫替丁中NDMA 的檢測至今未見報道。然而，由于原料藥不同，其理化性質(zhì)不同導致提取方法、色譜保留行為均有差異，因此測定其它藥物中NDMA的文獻方法不能直接應用于法莫替丁中NDMA的測定，亟需重新開發(fā)方法。靜電場軌道阱(Orbitrap)高分辨質(zhì)譜技術(shù)由于其高靈敏度、高質(zhì)量精度的優(yōu)勢，在藥物雜質(zhì)分析領(lǐng)域應用廣泛[19]。本研究首次建立了用于測定法莫替丁及其制劑中NDMA含量的超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法(UHPLC-Orbitrap HRMS)，樣品前處理簡便快速，靈敏度高、專屬性強，已用于法莫替丁及其制劑中NDMA的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Thermo Q Exactive PlusTM超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)包括Ultimate 3000液相泵、自動進樣器、柱溫箱以及Orbitrap高分辨質(zhì)譜部分(美國Thermo Fisher Scientific Inc.)；XCalibur 4.0軟件(美國Thermo Fisher Scientific Inc.)用于質(zhì)譜儀控制和數(shù)據(jù)處理；Mettler XS205型電子天平(瑞士Mettler-Toledo LLC)；Heraeus Multifuge X1R型高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific Inc.)；KQ-500 DE型溫控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；THZ-82型水浴恒溫振蕩器(常州金壇精達儀器制造有限公司)；2 mL一次性使用無菌注射器(山東新華安得醫(yī)療用品有限公司)；13 mm、0.22 μm 微孔濾頭(上海安譜實驗科技股份有限公司)。

NDMA對照品(含量為99.5%，TCI公司)；甲醇、乙腈、甲酸均為HPLC級(美國Thermo Fisher Scientific Inc.)；實驗用純水(18.2 MΩ·cm)由Millipore Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(美國Merckmillipore Inc.)制得。11批法莫替丁原料、36批法莫替丁鈣鎂咀嚼片(每片含法莫替丁10 mg)及輔料均為藥企委托檢驗提供。

1.2 對照品及供試品溶液的制備

1.2.1 對照品溶液取NDMA對照品適量，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得1.00 mg/mL的NDMA對照品儲備液；精密移取上述儲備液1.0 mL于100 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻得10.00 μg/mL的對照品溶液；同法以甲醇逐步稀釋，得1.00、2.00、5.00、10.00、50.00、100.00 ng/mL的系列質(zhì)量濃度對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液法莫替丁供試品溶液(1.00 mg/mL)：取供試品約10 mg，精密稱定，置于50 mL離心管中，加入10 mL甲醇，渦旋混勻1 min使其完全溶解，即得。

法莫替丁鈣鎂咀嚼片供試品溶液(1.00 mg/mL)：取本品5片，精密稱定，研細，稱取細粉適量(約相當于法莫替丁10 mg)至50 mL離心管中，加入10 mL甲醇，渦旋混勻1 min，再以350 r/min振搖40 min，于10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即得。

1.3 色譜條件

色譜柱為ACE EXCEL 3 C18-AR(150 mm × 4.6 mm,3 μm)，流速：0.50 mL/min；柱溫：30 ℃；自動進樣器溫度：4 ℃；進樣量：5 μL。流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈。梯度洗脫程序：0～1.0 min，5%B；1.0～3.0 min，5%～20%B；3.0～7.0 min，20%～100%B；7.0～9.0 min，100%B；9.0～9.1 min，100%～5%B；9.1～14.0 min，5%B。六通閥切換設置：保留時間5.00～7.00 min的流動相進入質(zhì)譜，其余時間的流動相進入廢液。按外標法以峰面積計算供試品中NDMA含量。

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，采用正離子平行反應監(jiān)測(PRM)掃描模式，掃描范圍：m/z50～95，掃描m/z：75.055 6，隔離窗口：m/z1.5，碰撞能量(NCE)：30。鞘氣流速：55 arb(arbitrary units)，輔助氣流速：15 arb，噴霧電壓：3.5 kV，離子傳輸管溫度：350 ℃，輔助氣加熱溫度：400 ℃。

圖1 NDMA的PRM模式高分辨質(zhì)譜圖Fig.1 High resolution mass spectrum of NDMA in PRM mode

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件的考察

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化《化學藥物中亞硝胺類雜質(zhì)研究技術(shù)指導原則(試行)》[3]規(guī)定NDMA的可接受攝入限度為96 ng/d，而法莫替丁鈣鎂咀嚼片的最大攝入量為20 mg/d，二者的比值4.80×10-6(即4.8 ppm)即為法莫替丁及法莫替丁鈣鎂咀嚼片中NDMA的允許限度。根據(jù)供試品溶液中法莫替丁的質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL，NDMA的定量下限須低于2.40 ng/mL(即NDMA限度濃度4.8 ng/mL的50%)，對儀器靈敏度性能要求很高。但NDMA是低質(zhì)量數(shù)化合物，其母離子m/z僅為75.055 6，質(zhì)譜檢測時基線噪音較大，影響色譜峰信噪比，導致靈敏度較低。為此，考察了全掃描(Full MS)、目標物選擇性離子檢測(Targetd SIM)、全掃描-數(shù)據(jù)依賴的二級掃描(Full MS/dd MS2)、平行反應監(jiān)測(PRM)等不同的質(zhì)譜掃描模式，發(fā)現(xiàn)PRM模式下NDMA的基線噪音最低、信噪比最高，其信噪比高于其他掃描模式10倍以上。應用XCalibur 4.0軟件選擇最佳碰撞能量、提取離子，并對離子源氣流速、溫度、電壓進行優(yōu)化，最終實現(xiàn)了NDMA檢測的靈敏度要求。最佳質(zhì)譜條件如“1.4”所示，NDMA的高分辨質(zhì)譜圖如圖1所示。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化供試品溶液中含有高質(zhì)量濃度的法莫替丁(1.00 mg/mL)和痕量的NDMA(<100.00 ng/mL)，如果高濃度法莫替丁進入質(zhì)譜系統(tǒng)，會污染離子源并產(chǎn)生嚴重的基質(zhì)效應，影響痕量NDMA的準確測定。因此，應使NDMA和法莫替丁達到足夠的色譜分離度，通過六通閥將法莫替丁色譜峰切換到廢液，避免高濃度法莫替丁進入質(zhì)譜?？疾炝薃CE EXCEL 3 C18-AR(100 mm×4.6 mm,3 μm)色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)NDMA和法莫替丁的色譜分離較差，二者保留時間僅相差1.3 min，對閥切換造成了困難。改用ACE EXCEL 3 C18-AR(150 mm×4.6 mm,3 μm)色譜柱，NDMA的保留時間約為6.15 min，與主成分法莫替丁的保留時間差值增至2.4 min，實現(xiàn)了較好的色譜分離，通過六通閥僅將保留時間5.00～7.00 min的流動相進入質(zhì)譜，有效避免了高濃度法莫替丁的基質(zhì)干擾，保護了離子源，使NDMA的測定更加準確可靠。優(yōu)化的色譜條件如“1.3”所示。

2.1.3 樣品預處理方法的優(yōu)化NDMA易溶于水、醇，但法莫替丁在冰醋酸中易溶，在甲醇中微溶，在水中幾乎不溶。本實驗分別以冰醋酸和甲醇作為溶劑配制1.00 mg/mL的法莫替丁和5.00 ng/mL NDMA混合溶液，平行測試6次(n=6)。結(jié)果顯示，冰醋酸中NDMA的平均色譜峰面積僅為在甲醇中峰面積的34.2%。原因可能為暴露在酸中的NDMA在前處理過程中不穩(wěn)定所致。因此，本實驗選用甲醇作為提取溶劑，并控制稱樣量使主成分法莫替丁的質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL(濃度過高則法莫替丁過飽和)。此外，還考察了振搖時間對NDMA提取的影響，發(fā)現(xiàn)振搖20、40、60、90 min時，陰性樣品加標溶液中5.00 ng/mL NDMA的色譜峰面積分別為421 078、497 403、518 269、513 247，提取時間為40、60、90 min時的NDMA峰面積無顯著差異，故選擇振搖時間為40 min。本實驗前處理簡單，提取效果好。

2.2 方法學驗證

2.2.1 專屬性將溶劑(甲醇)、處理后的輔料溶液、NDMA對照品溶液、法莫替丁溶液、加標回收溶液分別進樣測定，NDMA的出峰時間為6.16 min，相同保留時間處的溶劑及輔料溶液均無干擾峰。輔料溶液、NDMA對照品溶液和加標回收溶液的提取離子色譜圖見圖2。法莫替丁的保留時間為8.57 min，對NDMA色譜峰無干擾。以上結(jié)果表明本方法的專屬性良好。

圖2 提取離子色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatogramsA:excipients；B:NDMA standard solution；C:sample of recovery test

2.2.2 基質(zhì)效應分別制備低(2.50 ng/mL)、中(5.00 ng/mL)、高(7.50 ng/mL)3個水平的空白基質(zhì)加標溶液和對照品標準溶液，分別進樣測定，計算兩種溶液中NDMA響應值的百分比，即為基質(zhì)效應。結(jié)果表明，NDMA在低、中、高3個不同濃度下的基質(zhì)效應為91.4%～102.7%，表明基質(zhì)不影響NDMA的質(zhì)譜測定。

2.2.3 線性范圍將“1.2.1”配制的系列濃度對照品溶液進樣測定。以所得峰面積為縱坐標(y)，NDMA標準溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(x，ng/mL)，加權(quán)重1/x2擬合線性校正曲線，建立回歸方程，并計算相關(guān)系數(shù)(r)。結(jié)果表明，NDMA在1.00～100.00 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=98 665x-19 485，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7。

2.2.4 檢出限與定量下限精密移取1.00 ng/mL的NDMA標準溶液，以甲醇為溶劑逐級稀釋，采用本方法進行測定，按信噪比S/N≥3計算檢出限，S/N≥10計算定量下限。結(jié)果表明方法的檢出限為0.20 ng/mL，定量下限為1.00 ng/mL。

2.2.5 回收率與相對標準偏差考察低、中、高3個濃度的NDMA在法莫替丁及其制劑中的回收率和相對標準偏差(RSD)。取已知未檢出NDMA的陰性樣品約1次服用量(以法莫替丁計10 mg)，法莫替丁原料藥(API)及制劑均精密稱取9份(低、中、高水平各3份)，分別精密加入適量的NDMA對照品溶液，后續(xù)操作按照“1.2.2”方法處理，進樣測定，按外標法計算NDMA含量。由表1可知，3個加標濃度下NDMA在法莫替丁及制劑中的平均回收率為98.5%～108%，RSD為2.3%～6.7%，符合藥典規(guī)定，表明NDMA的回收率和重復性良好。

表1 NDMA在法莫替丁及其制劑中的回收率及相對標準偏差(n=3)Table 1 Recoveries and RSDs of NDMA in famotidine API and preparations(n=3)

2.2.6 穩(wěn)定性將2.00 ng/mL的NDMA標準溶液保存于進樣瓶中，在自動進樣器中按照實驗條件放置0、4、8、12、24、48 h后進樣測定，記錄色譜圖和峰面積。結(jié)果顯示，NDMA峰面積的RSD為6.9%，說明該條件下NDMA在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 耐用性采用2.00 ng/mL的NDMA標準溶液考察了方法的耐用性。將超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的柱溫分別調(diào)整為27、33 ℃，流動相流速分別調(diào)整為0.45、0.55 mL/min時，NDMA的色譜圖峰形無變化，保留時間和峰面積發(fā)生微小改變，表明測定條件輕微變動不影響NDMA的測定，方法耐用性良好。

2.3 樣品測定

將47批法莫替丁及制劑樣品按照“1.2.2”方法制備供試品溶液，按照“1.3” 和“1.4”條件進樣測定，記錄色譜圖和峰面積，外標法計算NDMA含量。按照法莫替丁中NDMA的限度要求4.8×10-6(即4.8 ppm)，在1批法莫替丁原料和2批法莫替丁制劑中檢出了超限的NDMA，測得其質(zhì)量濃度為6.77～9.73 ng/mL，含量為6.62×10-6～9.57×10-6(即6.62～9.57 ppm)。陽性樣品的測定結(jié)果如表2所示。

表2 陽性樣品的測定結(jié)果Table 2 Determination results of positive samples

3 結(jié) 論

本研究建立了法莫替丁中NDMA的UHPLC-Orbitrap HRMS法，進行了方法學驗證并將方法用于法莫替丁及其制劑中NDMA的測定。NDMA的線性范圍為1.00～100.00 ng/mL，檢出限和定量下限分別為0.20 ng/mL和1.00 ng/mL，低、中、高3個加標濃度下的平均回收率為98.5%～108%，RSD為2.3%～6.7%。將該法用于47批供試品中NDMA的測定，在1批法莫替丁原料和2批法莫替丁制劑中檢出了超限的NDMA。本方法靈敏度高、專屬性好、回收率高、線性范圍寬，操作簡便、快速，已用于法莫替丁及其制劑中NDMA的檢驗，填補了該研究技術(shù)空白。本研究有助于醫(yī)藥企業(yè)進行生產(chǎn)工藝控制，并為藥監(jiān)部門的監(jiān)管提供有力的技術(shù)支持。