姜 麗，梁峻毅，王玉彤，鮑林春，吳 韻，鄭玉國，夏光平，張小蘭，張仟春*

(1.興義民族師范學(xué)院 生物與化學(xué)學(xué)院，貴州 興義 562400；2.貴州省化學(xué)合成及環(huán)境污染控制和修復(fù)技術(shù)特色重點實驗室，貴州 興義 562400；3.黔西南州人民醫(yī)院 檢驗科，貴州 興義 562400)

碳量子點(Carbon quantum dots,CQDs)因具有良好的水溶性、光學(xué)穩(wěn)定性、出色的生物相容性、生物低毒性以及強熒光性能[1-4]，已在生物醫(yī)學(xué)成像、分析物檢測、熒光標記、催化劑、探針和光學(xué)元件等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[5-7]。目前，大量學(xué)者研究了多種制備CQDs的方法，主要有水熱法、化學(xué)氧化法、微波輔助法、電化學(xué)氧化法、激光刻蝕法和超聲法等[4,6]。在眾多的制備方法中，使用廉價和生態(tài)友好型生物質(zhì)的水熱法受到了廣大研究者的青睞，該法合成簡單、綠色環(huán)保、經(jīng)濟。前驅(qū)體的選擇是制備CQDs的關(guān)鍵，直接影響量子產(chǎn)率、熒光強度及穩(wěn)定性，是實際應(yīng)用中提高選擇性和靈敏度的重要因素。在CQDs的制備過程中通過原子摻雜(例如氮、磷、硼等)不僅可以提高CQDs的量子產(chǎn)率及熒光強度，還可在CQDs中提供活性位點，從而拓寬其在分析檢測等領(lǐng)域的潛在應(yīng)用[1,4,8]。氮外層有5個價電子且存在孤電子對，可提供多余的n電子，使費米能級上移從而改變光學(xué)性質(zhì)，同時氮原子與碳原子大小相當(dāng)，使得氮成為CQDs中的理想摻雜元素，拓寬了CQDs的應(yīng)用范圍[4]。因此，高含氮量的物質(zhì)常作為CQDs前驅(qū)體進行研究。

鄰硝基苯酚(o-Nitrophenol,o-NP)是酚類家族中的高劇毒物質(zhì)，是環(huán)境分析優(yōu)先監(jiān)測的污染物，美國環(huán)境保護署已將其列為優(yōu)先治理的對象[9]。因此，建立環(huán)境樣品中o-NP的分析方法具有重要意義。目前，硝基苯酚的常用分析方法有光譜分析法[9]、毛細管電泳法[10]、流動注射分析法[11]、高效液相色譜法[12]、氣相色譜-質(zhì)譜法[13]和電化學(xué)分析法[14]等。這些方法大多操作繁瑣、儀器價格昂貴、分析檢測成本高。而熒光分光光度法由于操作簡單，且具有良好的選擇性、靈敏性以及使用成本低等優(yōu)點，廣泛用于物質(zhì)的分析檢測[15-16]。

L-瓜氨酸和尿素的含氮量分別為24%和47%，是理想的氮摻雜前驅(qū)體。本文首次以L-瓜氨酸和尿素為混合前驅(qū)體，采用水熱法一步合成了氮摻雜碳量子點(N-CQDs)。對制備的N-CQDs進行表征，研究其發(fā)光特性和細胞毒性，并進一步用于細胞成像實驗，證實該N-CQDs具有水溶性好、穩(wěn)定性高、細胞毒性小、生物相容性好、熒光強度大和量子產(chǎn)率高的優(yōu)點，具有潛在的應(yīng)用價值。此外，基于o-NP對探針N-CQDs的選擇性猝滅效應(yīng)，以及o-NP濃度與N-CQDs熒光強度之間良好的線性關(guān)系，發(fā)展了一種簡單、快速、靈敏的實際水樣中o-NP的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

L-瓜氨酸、尿素、硫酸奎寧、磷酸鹽緩沖液(PBS)、對硝基苯酚(p-NP)、鹽酸多巴胺(DA)、Zn(NO3)2·6H2O、AlCl3、Cu(NO3)2·3H2O、MgCl2·6H2O、Fe(NO3)3·9H2O、CaCl2和1 000 μg/mL鄰硝基苯酚(o-NP)標準溶液購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；異丙醇、鄰苯二酚(CC)和對苯二酚(HQ)購于百靈威科技有限公司；NaCl、KCl和Hg(NO3)2·H2O購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)和DMEM培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司；實驗所用試劑均為分析純；HepG2細胞由黔西南州人民醫(yī)院提供；實驗用水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

Hitachi-F20高分辨透射電子顯微鏡(HRTEM)；Bruker multimode 8原子力顯微鏡(AMF)；Leica SP8激光共聚焦掃描顯微鏡(德國韋茨拉爾徠卡)；Nicolet 6700傅立葉變換紅外光譜儀(FT-IR)、ESCALAB 250Xi型光電子能譜儀(XPS)、Multiskan FC酶聯(lián)免疫檢測儀(美國賽默飛世爾)；D8 X射線粉末衍射儀(XRD，德國Bruker公司)；RF-6000熒光分光光度計(日本島津公司)；4501S紫外-可見光分光光度計(UV-Vis,天津港東科技發(fā)展股份有限公司)；KT7-900-434高速離心機(德國克恩達)；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器(中國昆山超聲儀器有限公司)；AL104電子天平(梅特勒-托利多公司)。

1.2 碳量子點的制備

稱取一定質(zhì)量比的L-瓜氨酸和尿素，加入20 mL超純水，超聲振蕩20 min使其分散完全，將所配溶液轉(zhuǎn)移至50 mL高壓反應(yīng)釜中，于180～240 ℃烘箱中反應(yīng)6～14 h。反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)釜，待其冷卻至室溫，將反應(yīng)液超聲分散30 min，于12 000 r/min超速離心20 min，以0.22 μm濾膜過濾后得到N-CQDs溶液，置于4 ℃冰箱中備用。

1.3 氮摻雜碳量子點的細胞毒性及生物成像

通過標準MTT法進行HepG2細胞的毒性檢測實驗，具體操作如下：首先，在37 ℃，5% CO2條件下將HepG2細胞加入到96孔平地板中培養(yǎng)24 h，細胞密度為4×103/孔。然后將細胞培養(yǎng)基取出，每孔加入100 μL含有不同質(zhì)量濃度N-CQDs(0～1 000 μg/mL)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，清洗細胞，向平地板中每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后吸去細胞培養(yǎng)基和MTT并用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，加入異丙醇，于100 r/min振蕩10 min，在450 nm波長的酶聯(lián)免疫檢測儀上測量每孔的光密度，計算細胞活性。

將100 μL含有10% PBS的新鮮DMEM和HepG2細胞(1×105/皿)加入培養(yǎng)皿中，于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，加入N-CQDs溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用PBS溶液(0.01 mol/L，pH 7.4)沖洗3次后，分別在488 nm和610 nm檢測波長下成像。

1.4 鄰硝基苯酚的檢測

取20.0 μL N-CQDs溶液(25 mg/mL)于5 mL比色管中，以PBS(0.1 mol/L,pH 7.4)緩沖液定容，加入5.0 μL不同濃度的o-NP溶液，室溫下反應(yīng)30 min，于380 nm激發(fā)波長下掃描其熒光發(fā)射光譜。N-CQDs的熒光猝滅率為IF/IF0，IF0為無o-NP的N-CQDs溶液的熒光強度，IF為加入o-NP后的熒光強度。

2 結(jié)果與討論

2.1 氮摻雜碳量子點的制備

為了獲得最佳熒光強度的N-CQDs，考察了L-瓜氨酸和尿素兩種前驅(qū)體的質(zhì)量比及兩者的質(zhì)量濃度、制備溫度和制備時間對N-CQDs熒光強度的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)L-瓜氨酸與尿素質(zhì)量比為3∶2時N-CQDs的熒光強度最佳(圖1A)。且當(dāng)L-瓜氨酸和尿素的質(zhì)量濃度在6.25～25 mg/mL范圍時，N-CQDs的熒光強度隨質(zhì)量濃度的增加而增大，并在25 mg/mL時達到最大值，此后隨著前驅(qū)體質(zhì)量濃度繼續(xù)增大，N-CQDs的熒光強度反而降低(圖1B)，這可能是由于較高濃度易引起N-CQDs聚集而導(dǎo)致熒光猝滅[17-18]所致。因此，選擇兩種前驅(qū)體的最佳質(zhì)量濃度均為25 mg/mL。實驗發(fā)現(xiàn)，N-CQDs的熒光強度隨制備溫度的升高而增強，并在240 ℃時達到最大值(圖1C)，考慮到對位聚苯內(nèi)膽反應(yīng)釜的安全性，選擇240 ℃作為制備的最佳溫度；制備時間對N-CQDs熒光強度也有明顯影響，制備時間為10 h時，熒光強度達到最大值(圖1D)，因此選擇10 h作為水熱制備的最佳時間。故N-CQDs的最佳制備條件為：L-瓜氨酸與尿素的質(zhì)量比與質(zhì)量濃度分別為3∶2和25、25 mg/mL，制備溫度為240 ℃，制備時間為10 h。

2.2 氮摻雜碳量子點的表征

通過HRTEM及AFM觀察制備的N-CQDs的形貌。圖2A顯示，N-CQDs為近圓形且單分散性良好的納米顆粒；其平均粒徑在2.8 nm左右(圖2A插圖)。從圖2B和圖2C可以看出，該N-CQDs的平均高度約2.7 nm。以上結(jié)果表明，所制備的N-CQDs是一種近乎微觀準球形的碳納米顆粒[19]。圖2D為N-CQDs的HRTEM圖，圖中顯示該N-CQDs晶格條紋的晶面間距為0.25 nm，與石墨碳相符;N-CQDs在2θ=22°處的較寬的平緩衍射峰(圖3A)對應(yīng)于石墨碳的(002)晶面[20],證實其為無定形碳結(jié)構(gòu)。

2.3 氮摻雜碳量子點的光致發(fā)光特性

通過三維熒光光譜測試了N-CQDs激發(fā)、發(fā)射吸收特征峰的大概范圍，結(jié)果如圖4A所示，其激發(fā)范圍為300～450 nm，發(fā)射范圍為350～550 nm。在350～390 nm波長激發(fā)下，其主要發(fā)射帶集中在415～478 nm，對激發(fā)波長具有一定的依賴性，這可能是由共軛π域的發(fā)射以及表面缺陷所致[29]。采用UV-Vis和熒光分光光度計考察了N-CQDs的光學(xué)吸收特征(圖4B)，該N-CQDs在290～600 nm范圍內(nèi)有較寬的紫外吸收峰(黑線)，可能是n-π*躍遷的結(jié)果[30]。該N-CQDs最佳的激發(fā)(藍線)和發(fā)射(紅線)波長分別為380 nm和453 nm。制備的N-CQDs溶液在日光下呈淡黃色，在365 nm紫外燈下，該N-CQDs發(fā)射出強烈的藍色熒光(圖4B插圖)，當(dāng)激發(fā)波長為380 nm時，在453 nm處出現(xiàn)最強熒光。以硫酸奎寧(0.1 mol/L H2SO4,QY=54%)為熒光標準物，測得N-CQDs的量子產(chǎn)率為39.2%。

2.4 氮摻雜碳量子點的穩(wěn)定性

實驗發(fā)現(xiàn)，采用尿素和L-瓜氨酸為前驅(qū)體制備的N-CQDs熒光強度比僅采用L-瓜氨酸制備的CQDs熒光強度高、穩(wěn)定性好。且N-CQDs可在12 h內(nèi)保持熒光強度基本不變，17 h后熒光僅減弱13.1%，不影響應(yīng)用。

圖5 pH值對N-CQDs熒光強度的影響Fig.5 Effect of pH value on the fluorescence intensity of N-CQDs

高酸堿性對N-CQDs具有明顯影響，為了獲得穩(wěn)定的實際樣品分析條件，考察了pH值對N-CQDs熒光強度的影響。發(fā)現(xiàn)在pH 4.0～8.0范圍內(nèi)，N-CQDs熒光強度變化較小，而在pH 1.0～4.0和pH>8.0時，熒光強度明顯減小(圖5)。因此，進行水樣中o-NP的含量分析時，在pH 7.4條件下進行檢測。

2.5 氮摻雜碳量子點的細胞毒性及生物成像

為了評估N-CQDs的細胞毒性，采用標準MTT法測定了用N-CQDs處理后HepG2細胞的活性。將HepG2細胞分別與不同劑量的N-CQDs培育24 h，當(dāng)N-CQDs的質(zhì)量濃度小于100 μg/mL時，細胞活性大于95%；N-CQDs質(zhì)量濃度達1 000 μg/mL時，其細胞活性仍可達到85%。該結(jié)果表明所制備的N-CQDs具有較低的細胞毒性，可用于生物標記。為了進一步證實N-CQDs在細胞成像中應(yīng)用的可行性，在37 ℃，5% CO2條件下，將HepG2細胞與質(zhì)量濃度分別為50 μg/mL和250 μg/mL的N-CQDs共培育24 h，并使用熒光顯微鏡在488 nm和610 nm檢測波長下進行觀察。結(jié)果顯示，在上述條件下細胞分別發(fā)出綠色(488 nm)和紅色(610 nm)的熒光，且綠色熒光的成像效果最佳(圖6)，同時經(jīng)250 μg/mL N-CQDs培育后的HepG2細胞成像效果優(yōu)于50 μg/mL N-CQDs培育后的成像效果。該結(jié)果表明N-CQDs具有良好的滲透性能和生物相容性，可作為生物體成像的探針使用。

圖6 HepG2細胞和N-CQDs(0、50、 250 μg/mL)培育24 h的共聚焦熒光圖像Fig.6 Confocal fluorescence images of HepG2 cells incubated with N-CQDs(0,50,250 μg/mL) for 24 h at two different excitation wavelengths including 488 nm(green) and 610 nm(red)

2.6 選擇性

考察了水中常見的Fe3+、Zn2+、K+、Hg2+、Al3+、Mg2+、Ca2+、Na+、Cu2+、HQ、DA、p-NP、CC等干擾物對測定的影響。如圖7所示，當(dāng)上述金屬離子及小分子與o-NP的濃度均為10 μmol/L時，各干擾物基本不影響o-NP的測定，說明N-CQDs熒光體系對o-NP具有良好的選擇性。

圖7 N-CQDs探針對o-NP的選擇性Fig.7 Selectivity of N-CQDs sensing system to o-NPa-n：blank，F(xiàn)e3+，Zn2+，K+，Hg2+，Al3+，Mg2+，Ca2+，Na+，Cu2+，HQ，DA，p-NP，CC

2.7 線性關(guān)系及檢出限

考察了不同濃度o-NP對N-CQDs體系熒光強度的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)o-NP濃度為0.083 3、0.333、0.666、1.00、2.00、4.00、5.00、6.00、8.00、10.0、12.0、30.0、60.0、90.0、 120、150 μmol/L時，體系的熒光強度隨o-NP濃度的增加逐漸降低，體系發(fā)生不同程度的熒光猝滅，且N-CQDs熒光猝滅程度與o-NP濃度(c)在0.083 3～12.0 μmol/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，線性方程為IF/IF0=0.0128 8c+1.027 16,r2=0.998，檢出限(S/N=3)為25.2 nmol/L，低于美國國家環(huán)境保護署的標準19.4 μmol/L[31]，且低于先前一些關(guān)于o-NP檢測文獻的報道(表1)，表明該N-CQDs可用于地表水樣中o-NP的檢測。

2.8 實際樣品測定

采集貴州省興義市萬峰湖景區(qū)湖水和頂效河河水樣品，經(jīng)12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心后，以0.22 μm濾膜濾除雜質(zhì)，采用本方法測定，結(jié)果如表2所示。本方法測定o-NP的回收率為85.2%～112%，相對標準偏差為2.8%～3.7%。結(jié)果表明，本方法具有較好的準確性，可用于實際樣品中o-NP含量的檢測。

表1 本方法與其他o-NP測定方法的比較Table 1 Comparison of the proposed method with other reports for o-NP determination

表2 實際樣品中鄰硝基苯酚的測定(n=3)Table 2 Detection of o-nitrophenol in real samples(n=3)

3 結(jié) 論

本研究以L-瓜氨酸和尿素為前驅(qū)體，通過水熱法一步合成了分散性良好、球形規(guī)則、尺寸均一、平均粒徑為2.8 nm的N-CQDs，該N-CQDs顯示了良好的生物相容性和低細胞毒性，可用于體外HepG2細胞成像。此外，鄰硝基苯酚可與N-CQDs的表面親水性基團(—COOH、—OH和—NH2)進行選擇性絡(luò)合導(dǎo)致量子點的熒光猝滅，熒光猝滅程度與鄰硝基苯酚濃度在0.083 3～12.0 μmol/L范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系，檢出限為25.2 nmol/L。所建立的方法簡單、快速，應(yīng)用于環(huán)境水樣中鄰硝基苯酚的測定，結(jié)果滿意。