楊建剛，李吟平，麻紀斌，張俏

(1.陜西醫(yī)藥控股醫(yī)藥研究院有限公司，陜西 西安 710075；2.陜西中藥研究所，陜西 西安 712000)

疏肝膠囊由山楂、丹參、澤瀉、決明子等藥材經(jīng)過提取、濃縮、精制而制成的復(fù)方制劑，具有降脂護肝、改善肝臟代謝的功效，其中丹參為方中君藥，現(xiàn)代藥理研究表明，丹參對具有動脈硬化實驗動物有降低肝脂的作用[1-2]。丹參中有效成分有丹參酮ⅡA、丹參素等[3-4]。丹參酮ⅡA、丹參素都可以作為本復(fù)方制劑中丹參的含量控制指標。但丹參素相對于丹參酮ⅡA更穩(wěn)定，并同樣具有擴張冠脈、降血脂、加強脂質(zhì)代謝的作用[5]。故選用更穩(wěn)定的丹參素作為復(fù)方制劑中丹參的控制指標。本研究通過對疏肝膠囊中丹參素檢測方法進行驗證，確保檢測準確，進而保證疏肝膠囊質(zhì)量可控。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

甲醇，色譜純；甲醇、冰醋酸、鹽酸、無水乙醇均為分析純；丹參素鈉(批號0752—9907，含量測定用)，中國藥品生物制品鑒定所。

Waters e2695高效液相色譜儀；AG-135電子天平；Cary50紫外分光光度計；H5150D超聲波。

1.2 溶液配制

1.2.1 對照品溶液的制備 稱取經(jīng)干燥過的丹參素鈉對照品適量，至棕色量瓶中，加色譜純甲醇溶解，定容，制成每1 mL含0.08 mg(相當于每1 mL含丹參素0.072 mg)的溶液，作為對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 取疏肝膠囊內(nèi)容物研細，精密稱取2.0 g，置50 mL棕色量瓶中，加水適量，超聲30 min，放冷，過濾于50 mL棕色量瓶，加水至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

1.2.3 陰性對照溶液的制備 按疏肝膠囊處方比例及工藝參數(shù)制備缺少丹參藥材的樣品，按照供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按檢測丹參素的色譜條件測定，結(jié)果顯示陰性對照溶液在丹參素色譜峰相應(yīng)的保留時間處無色譜峰，表明疏肝膠囊樣品丹參素檢測雜質(zhì)無干擾。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.4%醋酸溶液(5∶95)，流速1.0 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。理論板數(shù)按丹參素峰計算應(yīng)不低于2 000。

1.3.2 測定法 按照檢測丹參素的色譜條件，分別吸取丹參素對照品溶液與疏肝膠囊供試品溶液各適量于2 mL進樣瓶中，采用自動進樣，進樣量10 μL，記錄相應(yīng)色譜圖，按外標法以峰面積計算樣品含量。對照品和供試品高效液相色譜圖見圖1。

圖1 標準品、供試品和陰性對照色譜圖Fig.1 Standard(A)，sample(B) and negative control chromatogram A.標準品色譜圖；B.供試品色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 掃描波長確定

取丹參素鈉對照品適量，用甲醇配制對照品溶液(0.80 mg/mL)，以甲醇為空白，進行波長掃描，最大吸收波長為280 nm。故本方法選擇280 nm為丹參素鈉檢測波長。

2.2 流動相選擇

試用了甲醇-水(50∶50)、乙腈-水(5∶95)等為流動相檢測丹參素，色譜峰與相鄰峰分離度<1.5，最終本方法選用甲醇-0.4%醋酸溶液(5∶95)為流動相，分離效果很好，分離度>1.5。

2.3 丹參素測定的方法學(xué)驗證

2.3.1 線性關(guān)系的考察 精密稱取丹參素鈉對照品14.00 mg(相當于丹參素12.60 mg)，用蒸餾水溶解并定容于50 mL棕色量瓶中(丹參素0.252 mg/mL)，作為儲備液。分別吸取1.0，2.0，3.0，5.0，8 mL于 10 mL 容量瓶中，用水定容，作為丹參素標準系列溶液進行高效液相檢測，結(jié)果見表1。以丹參素色譜峰對應(yīng)的濃度(X)為橫坐標，對應(yīng)峰面積(Y)為縱坐標，丹參素回歸方程為Y=6.167×106X-4.337×103，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9(n=5)。結(jié)果表明，丹參素對照品在0.025 2～0.201 6 mg/mL濃度范圍，丹參素對照品濃度與峰面積之間呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

表1 丹參素線性實驗Table 1 Danshensu linear test

2.3.2 精密度實驗 吸取丹參素對照品溶液與疏肝膠囊供試品溶液各適量分別于2 mL進樣瓶中，采用自動進樣，進樣量10 μL，對照品溶液和供試品溶液分別連續(xù)進樣5次，記錄峰面積，計算RSD值，結(jié)果見表2、表3。

表2 丹參素對照品溶液精密度Table 2 Precision of Danshensu control solution

由表2可知，丹參素鈉標準溶液精密度實驗良好，RSD 0.50%。

表3 疏肝膠囊供試品溶液精密度Table 3 Precision of test solution of Shugan capsule

由表3可知，疏肝膠囊供試品溶液精密度實驗良好，RSD 0.94%。

2.3.3 溶液穩(wěn)定性實驗 吸取丹參素對照品溶液與疏肝膠囊供試品溶液各適量分別于2 mL進樣瓶中，采用自動進樣，進樣量10 μL，對照品溶液和供試品溶液分別在0，1，2，6，12 h進樣，記錄峰面積，計算RSD值，結(jié)果見表4、表5。

表4 丹參素對照品溶液穩(wěn)定性實驗Table 4 Stability test of Danshensu control solution

由表4可知,丹參素鈉標準溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD
1.06%。

表5 疏肝膠囊供試品溶液穩(wěn)定性實驗Table 5 Stability test of test solution of Shugan capsule

由表5可知，疏肝膠囊供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD
1.52%。

2.3.4 重現(xiàn)性實驗 取批號20190321疏肝膠囊樣品，取出內(nèi)容物研細，分別配制5份供試品溶液，色譜條件進行測試，記錄峰面積，按照外標法計算供試品含量，結(jié)果見表6。

表6 重現(xiàn)性實驗Table 6 Reproducibility test

由表6可知，疏肝膠囊供試品中丹參素平均含量為0.24%，RSD
1.24%，重現(xiàn)性良好。

2.3.5 加樣回收實驗 取疏肝膠囊樣品(批號20190321，含量0.24%)，取出內(nèi)容物，研細，配制供試品儲備液，濃度0.094 4 mg/mL，精密量取疏肝膠囊儲備液5 mL于10 mL棕色容量瓶中(量取6份分別于6個10 mL棕色容量瓶中)，同時分別精密加入對照品溶液(丹參素0.252 mg/mL)2 mL，加水稀釋并定容。按色譜檢測方法進行6次回收實驗，記錄峰面積，用外標法計算每份溶液丹參素總量，并分別計算每份溶液回收率，結(jié)果見表7。

表7 回收率實驗結(jié)果(n=6)Table 7 Results of recovery experiment

由表7可知，丹參素含量的回收率在97.42%～101.98%之間，RSD值1.60%，回收率良好。

2.4 三批疏肝膠囊含量測定

經(jīng)過方法學(xué)的驗證實驗，證明該方法可以用于疏肝膠囊中丹參素含量的測定，因此按色譜條件，對20181025，20190321，20190416三批成品測定，結(jié)果見表8。

表8 三批樣品含量測定Table 8 Determination of three batches of samples

由表8可知，三批成品丹參素含量穩(wěn)定。

3 結(jié)論

采用高效液相色譜測定疏肝膠囊中丹參素的含量，色譜柱為Kromasil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.4%醋酸溶液(5∶95)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長為280 nm。疏肝膠囊供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。方法的檢測結(jié)果準確，操作簡便，重現(xiàn)性好，可用于疏肝膠囊中丹參素的質(zhì)量控制。