姚 娜，黃燕明，李雪銀，陳桂生，康志英，3，徐 超，張立明

(1.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.隆德縣六盤山中藥資源開發(fā)有限公司，寧夏 固原 756300；3.廣東香雪南藥發(fā)展有限公司，廣東 肇慶 526642；4.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏 銀川 750000；5.寧夏醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004)

標(biāo)準(zhǔn)湯劑又稱標(biāo)準(zhǔn)煎液，是一種傳統(tǒng)的臨床廣泛使用的用藥形式。標(biāo)準(zhǔn)湯劑系遵循中醫(yī)藥理論，按照臨床湯劑煎煮方法規(guī)范煎煮，固液分離，經(jīng)適當(dāng)濃縮制備或經(jīng)適宜方法干燥制得，作為衡量中藥配方顆粒是否與臨床湯劑基本一致的標(biāo)準(zhǔn)參照物。

綿馬貫眾為鱗毛蕨科植物粗莖鱗毛蕨DryopteriscrassirhizomaNakai的干燥根莖和葉柄殘基。秋季采挖，削去葉柄、須根，除去泥沙，曬干。道地產(chǎn)區(qū)為吉林，主產(chǎn)區(qū)有黑龍江、吉林和遼寧。其具有清熱解毒，驅(qū)蟲的功效，臨床上多用于治療蟲積腹痛、瘡瘍[1-2]。藥理研究表明，綿馬貫眾有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、驅(qū)蟲等作用[3-4]。綿馬貫眾主要化學(xué)成分有間苯三酚類、黃酮類、萜類、甾體類、苯丙素類以及脂肪族類化合物等[5-8]。綿馬貫眾屬于冷背藥材，對(duì)其研究報(bào)道不多。目前，關(guān)于綿馬貫眾標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備及標(biāo)準(zhǔn)研究未見報(bào)道。本研究從標(biāo)準(zhǔn)湯劑的角度，收集15批綿馬貫眾飲片為原料，依據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》和《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》，對(duì)其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備研究，并進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，以期為綿馬貫眾水提物及配方顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；MS204TS萬分之一電子分析天平(瑞士Mettler toledo公司)；Simplicity超純水器(美國密理博Millipore公司)；KQ500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

綿馬貫眾對(duì)照藥材(中國食品藥品檢定研究所，121034-200302，規(guī)格：1.0 g/瓶)。

乙腈(天津賽孚瑞公司，色譜級(jí))；醋酸為分析純，GENERAL-REAGENT；甲醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑廠，分析純)。

1.3 樣品

共收集15批綿馬貫眾飲片，均為野生品，遼寧西豐縣3批，吉林白山6批，黑龍江伊春3批，遼寧清原3批；包含了綿馬貫眾藥材的道地產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū)。樣品經(jīng)廣州市香雪制藥股份有限公司高級(jí)工程師康志英鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 綿馬貫眾飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備

取綿馬貫眾飲片100 g，加8倍量水，浸泡30 min，煎煮20 min，濾過；第二次加6倍量水，煎煮15 min，濾過，濾液合并，減壓濃縮至飲片投料量∶浸膏體積約為1∶1(g∶mL)的浸膏，冷凍干燥，即得。

2.2 綿馬貫眾飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑薄層鑒別

取本品粉末1.0 g，加沸水50 mL，攪拌使溶解，濾過，濾液用鹽酸酸化至pH=2～3，置分液漏斗中，用無水乙醚萃取3次，合并乙醚液，濃縮至干，殘?jiān)勇确? mL使溶解，作為供試品溶液。另取綿馬貫眾對(duì)照藥材1.0 g，加水50 mL，煎煮1 h，離心取上清液，同法制成對(duì)照藥材溶液。按照薄層色譜法(《中國藥典》2015版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述2種溶液，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-冰醋酸(12∶1∶0.25)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.3%堅(jiān)牢藍(lán)BB鹽稀乙醇溶液，日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點(diǎn)，見圖1。

注：1.綿馬貫眾對(duì)照藥材；2.標(biāo)準(zhǔn)湯劑(MAGZ-01)；3.標(biāo)準(zhǔn)湯劑(MAGZ-02)；4.標(biāo)準(zhǔn)湯劑(MAGZ-03)；5.標(biāo)準(zhǔn)湯劑(MAGZ-04)；6.標(biāo)準(zhǔn)湯劑(MAGZ-05)；7.標(biāo)準(zhǔn)湯劑(MAGZ-06)；8.標(biāo)準(zhǔn)湯劑(MAGZ-07)；9.標(biāo)準(zhǔn)湯劑(MAGZ-08)；10.標(biāo)準(zhǔn)湯劑(MAGZ-09)；11.綿馬貫眾對(duì)照藥材；12.標(biāo)準(zhǔn)湯劑(MAGZ-10)；13.標(biāo)準(zhǔn)湯劑(MAGZ-11)；14.標(biāo)準(zhǔn)湯劑(MAGZ-12)；15.標(biāo)準(zhǔn)湯劑(MAGZ-13)；16.標(biāo)準(zhǔn)湯劑(MAGZ-14)；17.標(biāo)準(zhǔn)湯劑(MAGZ-15)。

2.3 綿馬貫眾標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜研究

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Waters Symmetry?-C18色譜柱(柱長為25 cm，柱內(nèi)徑為4.6 mm，粒徑為5 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以1%醋酸溶液為流動(dòng)相B，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長為330 nm。

時(shí)間(min)流動(dòng)相A(%)流動(dòng)相B(%)0-1510→2090→8015-2520→4080→6025-4040→6060→40

2.3.2 參照物溶液制備 取綿馬貫眾飲片約1.0 g，精密稱定，加水50 mL，煎煮30 min，取出，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)舆m量甲醇超聲處理使溶解，取出，放冷，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為飲片參照物溶液。取綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成40 μg/mL的溶液，作為對(duì)照品參照物溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 取本品粉末1.0 g，精密稱定，精密加甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 取綿馬貫眾飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑,按供試品溶液制備方法制備，按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明，12個(gè)共有色譜峰的鑒定均不受溶劑因素干擾，具有良好的專屬性。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取同一批綿馬貫眾飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品依法制備，按色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，記錄色譜。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.1版)》進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示相似度均大于0.90，表明該儀器的精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批綿馬貫眾飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品，平行6份，依法制備，按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.1版)》進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示相似度均大于0.90，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，按色譜條件，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48 h進(jìn)樣分析，記錄色譜。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.1版)》進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示相似度均大于0.90，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜的構(gòu)建

取15批綿馬貫眾飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按供試品溶液制備方法和色譜條件測(cè)定，得到15批綿馬貫眾飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的色譜疊加圖(圖2)。根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定及各批次樣品均能檢出的原則，選擇了12個(gè)特征峰作為共有峰。

圖2 15批綿馬貫眾飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜疊加

2.6 綿馬貫眾飲片-提取液-凍干粉指紋圖譜關(guān)聯(lián)性分析

測(cè)定同批次飲片、提取液、標(biāo)準(zhǔn)湯劑溶液，制備方法制備供試品，測(cè)定，結(jié)果綿馬貫眾飲片、水提液、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉的色譜圖上均呈現(xiàn)12個(gè)共有峰(見圖3)，且相似度均大于0.90，說明綿馬貫眾飲片-水提液-凍干粉相關(guān)性良好。

圖3 綿馬貫眾飲片-水提液-標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜疊加

3 討論

本研究在薄層鑒別方法探索過程中，筆者首先參照《中國藥典》2015版一部“綿馬貫眾”【鑒別】項(xiàng)下薄層色譜方法，結(jié)果供試品色譜中在與飲片溶液色譜相應(yīng)的位置上，均沒有斑點(diǎn)出現(xiàn)，分析原因?yàn)閮龈煞凼怯娠嬈?jīng)過水煮后所得，大部分成分為極性大的物質(zhì)，環(huán)己烷為極性小的溶劑，藥典方法處理所得的供試品大多為小極性物質(zhì)，因此藥典方法不適用于凍干粉的薄層鑒別，于是更換薄層鑒別方法進(jìn)行探索。

在流動(dòng)相條件考察時(shí)，考察酸的種類及濃度對(duì)色譜峰型及分離度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1%醋酸色譜峰分離度較好，故選擇乙腈-1%醋酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

采用光電二極管陣列檢測(cè)器考察綿馬貫眾標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液在不同波長下色譜圖情況。供試品溶液在190～400 nm波長下進(jìn)行掃描，通過3D視圖和等吸收?qǐng)D譜進(jìn)行分析，通過供試品溶液在不同波長下的色譜圖比較發(fā)現(xiàn)，在230～400 nm波長范圍內(nèi)，基線較平穩(wěn)，250～330 nm信息逐漸增多，340 nm以后色譜峰信息逐漸減少，在330 nm色譜峰響應(yīng)值適中，信息量較大，故選330 nm作為檢測(cè)波長。

綜上所述，本試驗(yàn)中綿馬貫眾飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備方法簡單，所建立的TLC定性鑒別法及HPLC法測(cè)定指紋圖譜的方法簡便、可靠，可為綿馬貫眾配方顆粒的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。