謝 鵬，劉金海，耿勝男，張萌萌，張會(huì)麗

(鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，河南 鄭州 450000)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種血管內(nèi)毒素堆積導(dǎo)致的非炎癥性病變，具體病因目前仍未闡明[1-4]。研究表明，影響動(dòng)脈粥樣硬化的重要因素是氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的活性氧(ROS)[5-6]。內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定和血管功能正常的動(dòng)態(tài)平衡是通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞損傷與增殖來(lái)實(shí)現(xiàn)的[7-8]。因此，有效地控制內(nèi)皮細(xì)胞受損、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激性對(duì)AS具有積極的作用[9-11]。PNS是從三七中提取分離得到，研究發(fā)現(xiàn)，其含有皂苷活性物質(zhì)、微量元素、豐富的維生素等[12]。PNS能減少機(jī)體氧的消耗量，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)氧的耐受力，還可以使腦血管擴(kuò)張，血流量增加，具有抗血栓和抗凝血的功能，具有改善動(dòng)脈粥樣硬化程度等廣泛的藥理作用[13-17]。H2O2是一種主要的活性氧，能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)能力。本實(shí)驗(yàn)研究不同濃度的PNS對(duì)HUVECs損傷的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermos)；低溫離心機(jī)(Eppendorf)；電子天平(Sartorius)；高壓蒸汽滅菌鍋(施都凱儀器設(shè)備有限公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)；電泳儀(上海天能有限公司)；細(xì)胞粉碎機(jī)(Eppendorf)；顯微鏡(上海測(cè)維光電技術(shù)有限公司)；PCR儀(杭州郎基科學(xué)儀器有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺(sigma試劑有限公司)；吐溫-20(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；BSA蛋白濃度試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；FDA染色劑(阿拉丁試劑有限公司)；預(yù)染marker(上海雅酶生物科技有限公司)；細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)公司)；氯仿、乙醇、異丙醇(成都市科龍化工試劑廠)；三七總皂苷、MTT(Sigma-Aldrich)；MDA、SOD、LDH、GSH、GAPDH抗體(Cell Signaling公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞復(fù)蘇和傳代

37 ℃解凍細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至離心管，加10%完全培養(yǎng)基，1 000 rpm離心5 min，倒掉上清液。將細(xì)胞懸液繼續(xù)培養(yǎng)，實(shí)時(shí)更換培養(yǎng)液。

將原代細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，觀察細(xì)胞密度是否達(dá)到80%～90%，再進(jìn)行傳代。取出HUVECs，將2 mL無(wú)菌PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁2次。適量胰酶消化，加入10%完全培養(yǎng)液2 mL。緩慢吹打瓶壁，使細(xì)胞完全脫離。轉(zhuǎn)移至離心管中1 000 rpm離心5 min。根據(jù)細(xì)胞數(shù)量和生長(zhǎng)狀況，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)瓶中，標(biāo)記好細(xì)胞傳代時(shí)間和次數(shù)等信息。觀察細(xì)胞密度和狀態(tài)，繼續(xù)培養(yǎng)，選擇形狀相對(duì)穩(wěn)定的第3～5代的胞用于實(shí)驗(yàn)研究。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。將細(xì)胞懸液以每孔1×104的密度接種至96孔板，以每孔6×104的密度接種培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)至完全貼壁。

2.2 分組及給藥

將完全貼壁的細(xì)胞取出，并對(duì)其進(jìn)行分組?？瞻捉M細(xì)胞不施加任何干預(yù)因素；過(guò)氧化氫組細(xì)胞加入過(guò)氧化氫，終濃度為500 μmol/L；PNS-H組細(xì)胞加入PNS，終濃度為60 μmol/L，30 min后再加入H2O2作用；PNS-L組細(xì)胞加入PNS，終濃度為30 μmol/L，30 min后再加入H2O2作用。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.3 蛋白免疫印跡檢測(cè)蛋白

按照實(shí)驗(yàn)需求對(duì)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理，在收集的細(xì)胞中加入適量預(yù)冷的含有PMSF及磷酸酶抑制劑的裂解液(1 mL的裂解液加入100 μL的PMSF)，4 ℃裂解30 min，12 000 r/min低溫離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液。備用。

2.3.1 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白濃度 本實(shí)驗(yàn)中所使用的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(BSA)的濃度為0.5 mg/mL，依據(jù)表1進(jìn)行添加，上樣，記錄。加100 μL考馬斯亮藍(lán)染色液，靜置觀察。用酶標(biāo)儀在562 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定。

表 1 蛋白濃度梯度

2.3.2 電泳樣本的制備 在制好的蛋白樣品中加200 μL 5X上樣緩沖液(5X倍，1∶4=緩沖液∶樣本)。用沸水加熱15 min使其充分變相。

2.3.3 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá) 本實(shí)驗(yàn)分離膠為12%的分離膠和5%的壓縮膠配制而成。根據(jù)考馬斯亮藍(lán)法所測(cè)定的蛋白樣品濃度計(jì)算所需上樣量，然后加入1/4蛋白體積的5X上樣緩沖液，混勻后在沸水中煮15 min，制得蛋白樣品。在1.5 mm玻璃板中加入7～8 mL的分離膠，加入2～3 mL異丙醇封壓，排出氣泡，凝結(jié)后，棄異丙醇，加壓縮膠，加梳子，制得膠。將電泳套件置于電泳槽中，加入新鮮電泳液浸泡。垂直拔下梳子，用上樣針吸取所需的蛋白樣品加到凝膠加樣孔內(nèi)，加雙色預(yù)染蛋白Maker。電壓設(shè)為低電壓80 V，待Marker基本分離后加大電壓，直至電泳結(jié)束。設(shè)定轉(zhuǎn)膜電壓為110 V，時(shí)間75 min。切取PVDF膜，活化，倒入轉(zhuǎn)膜液，加冰轉(zhuǎn)膜。將蛋白膜放在5%脫脂牛奶封閉液中，37 ℃封閉1 h。加入按照1∶25 000稀釋(1X TBS-T稀釋)的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。1X TBST漂洗 PVDF膜4～5次，每次10 min。加入按照1∶25 000稀釋好的二抗，37 ℃孵育1 h。洗膜，將PVDF膜放在顯影儀上，撒上發(fā)光液，運(yùn)行軟件，選擇化學(xué)發(fā)光，設(shè)置曝光時(shí)間，進(jìn)行5 s、10 s拍照。

2.4 PCR檢測(cè)相關(guān)基因

2.4.1 總RNA的抽提 按照實(shí)驗(yàn)要求對(duì)樣本進(jìn)行處理，將裂解的細(xì)胞勻漿，加入0.2 mL氯仿，渦旋，室溫放置15 min。對(duì)不同細(xì)胞進(jìn)行編號(hào)。2～8 ℃，10 000 r離心15 min，用移液器將上層水相轉(zhuǎn)移至新Ep管中，加入500 μL的異丙醇，渦旋混勻，室溫放置10 min，2～8 ℃，10 000 r離心10 min，倒掉上清。加入75%的乙醇，渦旋10 s，2～8 ℃，7 500 r離心5 min，棄上清。放置在吸水紙上，進(jìn)行RNA沉淀干燥處理，加入50 μL水，混勻。

2.4.2 RNA逆轉(zhuǎn)錄 第一鏈進(jìn)行cDNA的合成，去基因組DNA反應(yīng)，按照說(shuō)明進(jìn)行溶液配置，42 ℃孵育5 min，4 ℃保存。將下表液體渦旋混勻后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，50 ℃孵育30 min，75 ℃孵育5 min，終止反應(yīng)。得到含有cDNA的混合液體，每個(gè)樣本需進(jìn)行4個(gè)目的基因的PCR實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次測(cè)試，把逆轉(zhuǎn)錄的4個(gè)含cDNA的樣本均稀釋3倍。然后再進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，剩余cDNA凍存。

對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞SOD、CAT、MDA、LDH、GSH這5個(gè)基因的ID進(jìn)行查詢(xún)與設(shè)計(jì)，再進(jìn)行基因序列的合成。

引物合成后離心處理，稀釋?zhuān)顾幸锏慕K濃度達(dá)到所需終濃度。PCR測(cè)試采用MonAmpTMChemoHS Qpcr Mix(None Rox)試劑，并按照該試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。進(jìn)行30次循環(huán)，檢測(cè)完畢后，導(dǎo)出PCR數(shù)據(jù)。

表2 引物名稱(chēng)及序列

2.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

量取6 mLPBS溶液，稱(chēng)取0.03 g的MTT粉末，溶解，混勻，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，4 ℃避光保存。取出HUVECs的96孔板，每孔加入20 μL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸取孔內(nèi)的上清液，加入0.2 mL的DMSO，孵育3～5 min，用酶標(biāo)儀在493 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算HUVECs存活率。細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組-空白組)/(對(duì)照組-空白組)×100%。

2.6 FDA染色

取0.01 g的FDA粉末溶于1 mL的丙酮中，配成終濃度為10 mg/mL的母液，放于4 ℃冰箱，使用時(shí)按1∶1 000進(jìn)行稀釋?zhuān)〕鯤UVECs的6孔板，棄去培養(yǎng)液，加入稀釋過(guò)的FDA溶液0.1 mL，孵育20 min，棄去液體，用PBS沖洗2次，放置于488 nm的熒光顯微鏡下進(jìn)行拍照。

3 結(jié)果

3.1 MTT檢測(cè)

由表3的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，H2O2組和各PNS組與空白組進(jìn)行對(duì)比，當(dāng)PNS濃度為60 μmol/L，內(nèi)皮細(xì)胞活性顯著增高(P<0.01)，表明此濃度對(duì)細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。當(dāng)PNS為30 μmol/L，細(xì)胞活力沒(méi)有明顯增高，藥物作用不明顯，但隨著劑量的增加，細(xì)胞存活率有所上升。

表3 不同濃度的PNS對(duì)H2O2損傷HUVECs活力的影響

3.2 FDA染色

由圖1可以看出，與H2O2組相比，當(dāng)PNS濃度在60 μmol/L時(shí)，細(xì)胞的密度最大，存活率最高。當(dāng)PNS濃度為30 μmol/L時(shí)，熒光效果不太明顯，細(xì)胞存活率不高，因此當(dāng)PNS濃度為60 μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞有很好的保護(hù)作用。

3.3 PCR檢測(cè)

由表4可以得出，不同濃度的PNS都會(huì)對(duì)SOD、MDA、LDH、GSH產(chǎn)生影響，空白組與H2O2組進(jìn)行對(duì)比，SOD、MDA的水平升高(P<0.01)，LDH、GS的水平降低(P<0.01)。不同濃度的PNS組與H2O2組對(duì)比，PNS濃度在60 μmol/L時(shí)，SOD、MDA的顯著上升(P<0.01)，LDH、GSH下降(P<0.01)。因此PNS濃度為60 μmol/L時(shí)對(duì)HUVECs的保護(hù)作用最為明顯。

圖1 FDA染色圖

圖2 不同組別SOD、GSH、MDA、LDH蛋白表達(dá)水平

表4 不同組別SOD、GSH、MDA、LDH mRNA表達(dá)

由圖2可以看出，與H2O2組相比，SOD、MDA增加(P<0.01)，空白組減少(P<0.01)。與H2O2組相比，LDH、GSH在H2O2組中顯著減少(P<0.01)，而在空白組中表達(dá)量最多(P<0.05)。當(dāng)PNS濃度為60 μmol/L時(shí)，對(duì)受損內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)能力最高。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用H2O2能透過(guò)細(xì)胞膜和核膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[18]，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，從而引起疾病的發(fā)生，對(duì)人體造成不可預(yù)知的危害，建立細(xì)胞損傷模型。通過(guò)Western blot和PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PNS可抑制LDH、GSH的表達(dá)，并提高SOD、MDA的含量，說(shuō)明PNS對(duì)受損內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡基因表達(dá)水平起到調(diào)控作用，且PNS高劑量組效果明顯，呈劑量依賴(lài)性。PNS在一定濃度可有效地保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受H2O2的損害，對(duì)預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化有重要意義。