鄭小燕，張慧慧，黃倩倩，申玉婷

(陽江市中醫(yī)醫(yī)院，廣東 陽江 529500)

神經(jīng)根型頸椎病屬中醫(yī)“痹證”“頸肩痛”范疇?！端貑枴らL刺節(jié)論》曰：“病在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛，寒氣至，名曰骨痹?！迸R床治以升陽解肌、通絡(luò)止痹，提高治療神經(jīng)根型頸椎病的療效，達(dá)到科學(xué)、有效、價(jià)廉、安全可靠的目的。

通絡(luò)頸肩巴布劑處方由葛根、黃芪、威靈仙、全蝎、甘草等八味中藥組成，為陽江市中醫(yī)醫(yī)院針灸科臨床使用多年的外用敷貼，其臨床應(yīng)用是將該處方中藥打粉，蜂蜜調(diào)和后，貼敷于病灶部位，臨床療效確切，深受患者認(rèn)可。隨后改良為更適合患者使用的載藥量大，且無刺激性的巴布劑，該制劑通過升陽解肌、通絡(luò)止痹之功效對(duì)頸椎病具有很好的臨床療效。本研究考察制備的巴布劑的透皮性能，選擇君藥葛根中有效成分葛根素為檢測指標(biāo)，考察其體外釋放度、離體透皮率及制備的巴布劑動(dòng)力學(xué)釋放行為，具體研究如下。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀：waters e2695；色譜柱：賽諾菲ODS HYPERSIC C18分析柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；電子天平：Sartorius ME215S(Max210 g d=0.01 mg)；RYJ-6A型藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(上海黃海藥檢儀器廠)；超純水機(jī)(上海惠分科學(xué)分析儀器有限公司)；KQ-300DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

通絡(luò)頸肩巴布劑(自制，批號(hào)：20041801、20041802、20041803)；葛根素(中國食品藥品檢定研究院)，批號(hào)：110752-200511)；甲醇為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純；清潔級(jí)小鼠，體重(20±5)g，由湖北省疾病控制中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，合格證號(hào)：(NO.4200695787)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(鄂)2019-0030。

2 條件與方法

2.1 色譜條件

色譜柱：C18分析柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(22∶78)檢測波長為250 nm，理論塔板數(shù)按葛根素峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣：20 μL。

2.2 樣品的制備

2.2.1 葛根素對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取葛根素(15.97 mg、16.02 mg)，分別置于200 mL容量瓶中，加30%乙醇，制成每1 mL含0.079 85 mg、0.080 1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取自制的通絡(luò)頸肩巴布劑一貼(批號(hào)：20041801)，除去蓋襯，稱取膏體約0.4 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，密封，精密加入60%乙醇50 mL，稱重，超聲處理15 min(120 W，頻率40 kHz)，放冷，用60%的乙醇補(bǔ)重，過濾，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

2.2.3 陰性溶液的制備 稱取不含葛根的其余藥材，自制成巴布劑，按上述“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，過濾，取續(xù)濾液即為陰性溶液。

3 方法專屬性

3.1 DAD檢測器純度檢驗(yàn)

吸取葛根素對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，進(jìn)入DAD檢測器對(duì)其進(jìn)行純度檢查，結(jié)果表明葛根素色譜峰無雜質(zhì)干擾，純度高(95.5%)。見圖1、圖2。

3.2 專屬性考察

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別將對(duì)照品溶液、供試品、陰性溶液各10 μL，進(jìn)樣、檢測，對(duì)照品、供試品在14 min左右出現(xiàn)葛根素色譜峰，陰性溶液無干擾。結(jié)果見圖3、圖4、圖5。

圖1 對(duì)照品DAD檢測器純度檢驗(yàn)

圖2 供試品DAD檢測器純度檢驗(yàn)

圖3 葛根素對(duì)照品色譜

圖4 供試品色譜

圖5 陰性溶液色譜

3.3 線性關(guān)系試驗(yàn)

精密稱取葛根素對(duì)照品16.02 mg，置于50 mL容量瓶中，加30%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為母液，分別在上述色譜條件下分別進(jìn)樣1 μL、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL，分別進(jìn)樣2次，測定峰面積，計(jì)算平均峰面積，以平均峰面積、對(duì)照品含量計(jì)算線性回歸方程：Y=4 224 309.291 9X-181 722.420 8(r=0.999 9)；表明葛根素在0.320 4 μg～6.408 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.4 精密度試驗(yàn)

取上述“2.2.1”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液，按“2.1”色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，計(jì)算葛根素的峰面積RSD為0.69%，表明儀器精密度良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取通絡(luò)頸肩巴布劑一貼(批號(hào)：20041801)，除去蓋襯，稱取膏體約0.5 g，精密稱定，置于錐形瓶中，密封，精密加入30%乙醇50 mL，稱重，超聲處理20 min(120 W，頻率40 kHz)，放冷，用30%的乙醇補(bǔ)重，過濾，取續(xù)濾液，按“2.1”色譜條件下，分別于1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣檢測，分別進(jìn)樣10 μL，計(jì)算葛根素的峰面積RSD為1.35%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取通絡(luò)頸肩巴布劑一貼(批號(hào)：20041801)，除去蓋襯，稱取膏體約0.5 g，稱取6份，精密稱定，置于錐形瓶中，密封，分別精密加入30%乙醇50 mL，稱重，超聲處理20 min(120 W，頻率40 kHz)，放冷，用30%的乙醇補(bǔ)重，過濾，取續(xù)濾液，按“2.1”色譜條件下，分別進(jìn)樣10 μL，計(jì)算葛根素的含量為280.42 μg/g，計(jì)算RSD為1.36%，表明實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定可行。

3.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品(批號(hào)：20041801)，搖勻，除去蓋襯，稱取膏體約0.25 g，稱取6份，精密稱定，各精密加入適量的葛根素對(duì)照品，分別精密加入30%乙醇50 mL，稱重，按上述“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，搖勻，過濾，取續(xù)濾液即得，分別進(jìn)樣10 μL，結(jié)果平均回收率為100.16%，RSD為1.42%，表明實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定可行。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.8 耐受性試驗(yàn)

取上述“2.2.2”項(xiàng)下制備的供試品樣品，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別在三根不同的色譜柱上測定葛根素的含量。結(jié)果表明在三根不同的色譜柱上測定結(jié)果無明顯差異。結(jié)果見表2。

表2 葛根素含量測定結(jié)果

3.9 定量限試驗(yàn)

精密稱取葛根素對(duì)照品5.25 mg，置于50 mL容量瓶中，加30%乙醇定容至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液，稀釋成一系列濃度的溶液，分別進(jìn)樣1 μL，檢測，當(dāng)信噪比S/N=10即為定量限，此時(shí)葛根素含量為5.08×10-3μg。

3.10 含量測定

取三批樣品，搖勻，按供試品溶液制法所得溶液，按上述“2.1”項(xiàng)色譜條件測定，進(jìn)樣10 μL，計(jì)算。結(jié)果見表3。

表3 三批驗(yàn)證樣品含量測定結(jié)果 (μg/g)

4 離體小鼠透皮率測定

4.1 離體小鼠透皮實(shí)驗(yàn)[1-2]

取清潔級(jí)小鼠，脫頸處死，用電動(dòng)剃刀將其腹部脫毛，脫毛切記不要損害外部皮膚，剝離小鼠皮膚，采用改良Franz擴(kuò)散池，將鼠皮置于接收池上，稱取通絡(luò)頸肩巴布劑0.50 g，精密稱定，貼敷于鼠皮部，將接收池內(nèi)加滿9%生理鹽水，水浴恒溫保持在(37±1) ℃，開啟磁力攪拌(設(shè)置攪拌速度為250 r/min)，分別于1、2、4、8、12、24 h取出接收池中的接收液，同時(shí)補(bǔ)充同量的恒溫生理鹽水(37±1) ℃。

4.2 通絡(luò)頸肩巴布劑透皮供試品溶液制備

分別將6個(gè)時(shí)間段接收液分別置水浴鍋蒸干，用30%乙醇溶液溶解，轉(zhuǎn)移至1 mL容量瓶中，并定容至刻度、搖勻，過濾，取續(xù)濾液即得。

4.3 離體透皮率含量測定

將上述制備的樣品，按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別注入高效液相色譜儀，分別進(jìn)樣10 μL，檢測，計(jì)算樣品中葛根素的含量及計(jì)算經(jīng)皮滲透的動(dòng)力學(xué)擬合。結(jié)果見表4、表5。

5 結(jié)果

由表5結(jié)果可知，通絡(luò)頸肩巴布劑中葛根素經(jīng)皮滲透動(dòng)力學(xué)擬合符合Higuchi方程，擬合度為0.918，表明葛根素有效組分含量逐步緩慢釋放，在皮膚角質(zhì)層進(jìn)行貯庫蓄積，從而進(jìn)行低速運(yùn)輸，表明該制劑為骨架型緩釋制劑。

表4 離體透皮率測定結(jié)果

表5 經(jīng)皮滲透動(dòng)力學(xué)擬合方程

6 討論

現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，葛根素能顯著增加頸椎肌肉群收縮力，增加肌纖維彈性，軟化韌帶，可阻止椎間盤纖維化和椎間盤退變[3]。

神經(jīng)根型頸椎病是頸椎病中的常見臨床亞型，在所有類型中它的發(fā)病率最高，占70.2%。其主要表現(xiàn)為頸肩臂部疼痛，上肢放射性麻木疼痛，上肢肌力減退，甚者出現(xiàn)肌肉萎縮[4]。

本實(shí)驗(yàn)制備的巴布劑通過藥動(dòng)學(xué)擬合，發(fā)現(xiàn)為骨架型透皮制劑。骨架型透皮貼比貯庫型更薄更小，且皮膚刺激性小，因此，患者的順應(yīng)性更好，為目前經(jīng)皮領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[5]。制備的通絡(luò)頸肩巴布劑緩控釋制劑可實(shí)現(xiàn)藥物釋放的定時(shí)、定位、定速，從而可使藥物發(fā)揮出更好的療效。