烏云索德，領(lǐng) 小，孟 和，昭日格圖

(1.內(nèi)蒙古大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

蓽茇(Long pepper)是胡椒科植物蓽茇(PiperlongumL.)的干燥近成熟或成熟果穗[1]，具有溫中散寒、理氣止痛的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，蓽茇具有顯著的降血脂作用，降血脂活性成分為蓽茇寧(piperlonguminine，GBN)[2-5]。藥物必須進(jìn)入血液循環(huán)才能產(chǎn)生作用，血液中藥物的性質(zhì)、濃度決定了其藥效和毒性[6]。超高液相色譜法(UPLC)具有靈敏度高、專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于藥物分析測定[7-9]。本研究采用超高效液相色譜儀建立了大鼠血清中蓽茇寧的含量測定方法并觀察不同給藥量與血液中藥物濃度的關(guān)系。該方法操作便捷、靈敏度高、選擇性好，可為蓽茇寧的吸收、代謝規(guī)律研究和臨床合理用藥提供參考依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 儀器

Waters Acquity UPLCTM超高效液相色譜儀(美國Waters公司，配有恒溫自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器、柱溫箱、Empower2色譜工作站)；MTN-2800D氮吹儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；TGL-16G冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；QL-901漩渦混合器(江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)；KQ-300VDE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；EL204-IC電子天平(上海 METTLER TOLEDO儀器有限公司)；Millipore-Q Plus超純水器(美國 Millipore公司)；RAININ 1 000 μL移液槍(上海 METTLER TOLEDO儀器有限公司)等。

1.2 材料

蓽茇寧(自制，純度>98%)；乙腈(色譜純，美國TEDIA公司)；水為超純水；其余試劑為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar雄性大鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供(生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京)2012-0001)，體重為(200±20)g。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取50 mg蓽茇寧，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成1 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱中保存。測定前用無水乙醇稀釋得不同濃度的對(duì)照品溶液，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 給藥樣品制備及給藥方法

采用0.5%的CMC-Na將蓽茇寧制成不同濃度的混懸液，大鼠隨機(jī)分成空白組和5個(gè)給藥組，5個(gè)給藥組分別按照50 mg·kg-1、100 mg·kg-1、200 mg·kg-1、500 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)灌胃3 d。末次給藥后0.5 h、1 h、2 h、2.30 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h取血，放置30 min，3 000 rpm離心15 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血清樣品處理方法

取大鼠血清500 μL，加入4倍量乙腈，渦漩混合1 min，10 000 rpm離心15 min，取上清液，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)尤?50 μL乙腈，渦漩溶解30 s，過0.22 μm微孔濾膜，進(jìn)行UPLC分析。

2.4 色譜條件和分析條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH shield RP18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters Corporation，USA)，流動(dòng)相：乙腈-水(1∶1)，檢測波長：338 nm，流速：0.4 mL·min-1；進(jìn)樣量：2 μL；色譜柱溫度：25 ℃。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法專屬性

取大鼠空白血清、加入蓽茇寧標(biāo)準(zhǔn)品的空白血清、大鼠灌胃蓽茇寧后的血清，分別按血清樣品處理方法操作(“2.3”項(xiàng)下方法)，各樣品分別取2 μL注入超高效液相色譜儀，得到UPLC色譜，見圖1。由色譜圖可知，蓽茇寧的保留時(shí)間為1.98 min，給藥血清樣品色譜分離良好，血清內(nèi)源性物質(zhì)不干擾蓽茇寧的測定。

(a)：空白血清；(b)：空白血清中加入蓽茇寧；(c)：大鼠灌胃蓽茇寧后血清

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

取空白血清500 μL，加入蓽茇寧標(biāo)準(zhǔn)系列溶液50 μL，配制成蓽茇寧濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、15.0 μg·mL-1的血清樣品。按照“2.3”項(xiàng)下血清樣品處理操作，取2 μL注入超高效液相色譜儀，得UPLC色譜建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以蓽茇寧濃度為橫坐標(biāo)，蓽茇寧峰面積為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，得到線性方程y=68.45x-52.24(r=0.999 3，加權(quán)因子為1/x)，表明血清中蓽茇寧在0.5～15.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與峰面積積分線性關(guān)系良好(見圖2)，定量限為0.5 μg·mL-1(信噪比>3)。

圖2 空白血清加入系列濃度的蓽茇寧后處理得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 精密度和準(zhǔn)確度

取500 μL空白血清，加入適量蓽茇寧標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到低、中、高3個(gè)濃度(0.5、5.0、10.0 μg·mL-1)的質(zhì)控樣品各5份，測定日內(nèi)及日間精密度。每天1次，連續(xù)測定5 d日間精密度(結(jié)果見表1)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，日內(nèi)及日間精密度(RSD)均小于6%，說明該方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度。

表1 大鼠血清中蓽茇寧的日間和日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度測定 (n=5)

3.4 穩(wěn)定性

分別配制低、中、高3種濃度的蓽茇寧大鼠血清樣品，于室溫放置，每隔2 h進(jìn)樣分析1次，考察蓽茇寧在樣品測定過程中的穩(wěn)定性。每一濃度進(jìn)行3次分析，結(jié)果表明樣品室溫放置24 h穩(wěn)定。

3.5 回收率

取大鼠空白血清500 μL，按照“3.2”項(xiàng)下方法制備低、中、高3種濃度(0.5、5.0、10.0 μg·mL-1)的質(zhì)控樣品，每種濃度進(jìn)行5次分析。另用乙腈代替血清，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理，制備相應(yīng)濃度的樣品，每種濃度進(jìn)行5次樣本分析，獲得相應(yīng)峰面積。結(jié)果表明回收率均大于65%，比較穩(wěn)定，結(jié)果見表2。絕對(duì)回收率=測得樣品濃度(C測)/理論樣品濃度(C理論)。

表2 大鼠血清中蓽茇寧的回收率測定 (n=5)

3.6 樣品測定

將Wistar大鼠分成6個(gè)組，分別為空白組和5個(gè)給藥組(灌胃給藥劑量分別為50 mg·kg-1、100 mg·kg-1、200 mg·kg-1、500 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1)，連續(xù)灌胃3 d，末次給藥后分別于0.5 h、1 h、2 h、2.30 h、3 h、4 h、6 h、8 h和12 h取血。采血后放置30 min，在3 000 rpm條件下離心15 min，取上清液。按照“2.4”項(xiàng)下方法處理，獲得血清樣品色譜，測定血清中蓽茇寧的濃度，測得藥時(shí)曲線見圖3。

圖3 大鼠灌胃不同劑量蓽茇寧后的血藥濃度-時(shí)間曲線

隨著灌胃劑量的增加，進(jìn)入血液中蓽茇寧的濃度也有增加的趨勢。5個(gè)劑量以200 mg·kg-1為界限出現(xiàn)兩種不同的情況：200 mg·kg-1以下劑量，即50 mg·kg-1、100 mg·kg-1時(shí)，第1次出現(xiàn)最大血藥濃度的時(shí)間為1 h，第2次出現(xiàn)最大血藥濃度的時(shí)間為3 h；200 mg·kg-1以上劑量，即500 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1時(shí)，第1次出現(xiàn)最大血藥濃度的時(shí)間為0.5 h。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，UPLC法具有靈敏度高、選擇性好、前處理方法簡單、回收率穩(wěn)定、分析時(shí)間短(僅需5 min)的優(yōu)勢，適用于大鼠血清中蓽茇寧的定性定量快速測定。

血藥濃度和時(shí)間曲線表明，隨著給藥劑量的增加，大鼠血清中的蓽茇寧濃度也逐漸升高?？紤]到大鼠的個(gè)體差異性，灌胃給藥后，隨著時(shí)間的延長，蓽茇寧血清濃度是以曲線的形式下降的。