李 巖，覃啟京，梁慧薈，麻小梅，何 青，李曼菲，朱 亮，賴思嘉，楊 鶴，王凱華

(廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院，廣西 南寧 530201)

還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)在很多生物體的化學(xué)反應(yīng)中起遞氫體的作用，對(duì)機(jī)體具有重要意義，而NADPH氧化酶(NOX)是細(xì)胞內(nèi)一組具有氧化活性的蛋白，包含NOX1-5，DUOX1-2七種催化亞基。NOX2首先在吞噬細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)，分布在多數(shù)器官中，是NOX亞型中分布最廣泛的。然而，越來越多的證據(jù)顯示，NOX2在非吞噬細(xì)胞內(nèi)也有表達(dá)，主要包括神經(jīng)元、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞等[1]。研究證明NOX2是其中影響腦損傷的重要亞型[2-3]，抑制NOX2的表達(dá)和活性可以減輕腦缺血再灌注損傷、血腦屏障破壞和腦水腫[4]。

壯醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方壯通飲主要由扶芳藤、參三七、黃花倒水蓮三味廣西特色壯藥配伍而成，是廣西壯族地區(qū)民間醫(yī)生根據(jù)壯醫(yī)理論從疏通人體“三道兩路”，調(diào)治巧塢(大腦)的角度出發(fā)，通過嚴(yán)謹(jǐn)配伍組成的治療腦梗死的經(jīng)驗(yàn)方[5]。扶芳藤為衛(wèi)矛科植物的莖葉，味辛，性平，具有通龍路火路、舒筋脈、止出血、散瘀血的功效。藥理學(xué)研究顯示，預(yù)給藥后大鼠腦缺血再灌注腦組織中的c-fos含量下降，提示其有減輕大鼠腦缺血再灌注損傷的作用[6]。急性毒性實(shí)驗(yàn)顯示，扶芳藤藥性平和，毒性較低[7]。參三七是五加科植物的干燥根，是廣西民間常用名貴藥，味甘，微苦、溫，具有除瘀血、通龍路、止血、消腫止痛的功效。藥理學(xué)研究表明，其能顯著降低大鼠腦組織和血液中過氧化脂質(zhì)的含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，具有保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用[5]。毒理研究表明，其劑量過大會(huì)出現(xiàn)溶血，停藥后可逐漸消失，臨床口服無溶血作用，安全可靠[8]。黃花倒水蓮為遠(yuǎn)志科植物的根或全株，味甘，性微溫，具有祛濕解毒、補(bǔ)虛消腫、活血止血之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其能顯著降低大鼠血清丙二醛含量，提高SOD活性，具有抗氧化、清除自由基等作用[10]；同時(shí)能夠延長(zhǎng)正常小鼠在缺氧和低溫狀態(tài)下的生存時(shí)間，具有抗氧化應(yīng)激作用[11]。毒理學(xué)研究表明其毒性很小，小鼠的最大耐受倍數(shù)為246～262倍[12]。“三道兩路”指“氣道”(壯語lohheiq)“谷道”(壯語dungxsaej)“水道”(壯語lohramx)三道和“龍路”“火路”兩路。“三道”是人體生命活動(dòng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)化生、儲(chǔ)藏、輸布、運(yùn)行的場(chǎng)所。龍路的功能主要是為人體各部分輸送營(yíng)養(yǎng)，約束人體內(nèi)血液的運(yùn)行，龍路的網(wǎng)絡(luò)遍布全身，其中樞在心臟，保障龍路的通暢是保證血液正常運(yùn)行的前提條件。“火路”是人體受到內(nèi)外刺激后，對(duì)刺激做出反應(yīng)的信號(hào)傳輸通路，相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的神經(jīng)系統(tǒng)。壯醫(yī)認(rèn)為人之所以能感知天地之變化，主要為火路之功能，其中樞在“巧塢”(大腦)[13]。本研究應(yīng)用體外培養(yǎng)的大鼠腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞缺糖缺氧模型，觀察壯通飲能否通過抑制NOX2對(duì)糖氧剝奪(Oxygen-glucose deprivation，OGD)導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 壯通飲的制備

壯通飲：扶芳藤30 g、參三七10 g、黃花倒水蓮25 g。藥材去除雜質(zhì)切制后，按組方劑量配比，加入生藥材10倍量的水，浸泡60 min 后，用TC-15 套式恒溫器250 V電壓加熱煎煮。沸騰后將電壓調(diào)低至150 V，保持微沸狀態(tài)煎煮1 h，濾取煎液。藥渣再加入生藥材8倍量的水，同法煎煮1 h，濾取煎液。合并2次煎液，于恒溫水浴鍋(100 ℃)蒸發(fā)去水分至濃稠狀，轉(zhuǎn)入恒溫烘箱(60 ℃)干燥，得干浸膏，稱重，收膏率為36.8%，4 ℃保存，備用。臨用前使用蒸餾水溶解浸膏至生藥材含量為2.0 g/mL。

1.2 動(dòng)物

出生2天的雌性SD大鼠，SPF級(jí)，體重8～12 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。許可證號(hào)：SCXK(粵)2014-004。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22～25 ℃，相對(duì)濕度60%～70%，光照周期12 h∶12 h。

1.3 試劑

夾竹桃麻素(Apo，大連美侖，000020170316)，DMEM-F12培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco，000020170406)，D-Hanks(中國(guó)吉諾，000020170321)，胎牛血清(FBS，美國(guó)Gibco，000020170312)，胰酶(美國(guó)Gibco，000020170325)，兔抗NOX2多克隆抗體(美國(guó)Abcam，000020170401)，羊抗鼠IgG抗體(中國(guó)博士德，000020170402)，二甲基亞砜(DMSO，美國(guó)sigma，000020170315)。

1.4 儀器

CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；低溫高速離心機(jī)(日立，CE16RX Ⅲ)

1.5 方法

本研究參照以往的方法[14]，取出生2天的SD大鼠處死，取腦皮質(zhì)，HanKs液洗3次，剪碎。①剪碎的組織轉(zhuǎn)入離心管中，加培養(yǎng)液，反復(fù)吹打后接種在培養(yǎng)瓶中；②剪碎的組織1 000 rpm離心5 min后取沉淀以0.25%胰酶消化5 min，以含血清的培養(yǎng)液終止消化，1 000 rpm離心5 min，取沉淀以完全培養(yǎng)液重懸并吹打成細(xì)胞懸液，接種在培養(yǎng)瓶中。差速黏附30 min后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。待較多細(xì)胞貼壁后換液，之后2～3天換液1次。培養(yǎng)7～12天長(zhǎng)成致密單層細(xì)胞后37 ℃搖床振蕩18 h，次日以0.25%胰酶消化仍貼壁的細(xì)胞以傳代，免疫熒光鑒定。

取第四代星形膠質(zhì)細(xì)胞，參照以往的研究方法[15]，棄培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞3次，加入無糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)皿放入?yún)捬豕?含95% N2和5% CO2)將厭氧罐置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，缺氧狀態(tài)下分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h后，更換正常培養(yǎng)液，繼續(xù)在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不同時(shí)間(復(fù)氧0 h、8 h、24 h)，模擬再灌注。實(shí)驗(yàn)分組：①正常對(duì)照組：即陰性對(duì)照組，細(xì)胞不作任何處理；②糖氧剝奪組：?jiǎn)渭兲茄鮿儕Z組中的細(xì)胞，不加藥物干預(yù)，僅在密閉容器內(nèi)培養(yǎng)6 h、12 h、24 h；③藥物組：在進(jìn)行糖氧剝奪處理前1 h分別加入含壯通飲的培養(yǎng)液(濃度分別為20、40、80 mg·L-1)和夾竹桃麻素(NOX2抑制劑，濃度分別為0.05、0.25、0.5 mg·mL-1)。

1.5.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞活性測(cè)定 采用CCK-8試劑盒測(cè)定，具體步驟參照以往研究方法[16]，細(xì)胞存活率(%)=(待測(cè)孔吸光度值-空白孔)/(對(duì)照組吸光度值-空白孔)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5.2 免疫熒光染色 免疫熒光標(biāo)記參照以往的研究方法[17-18]。種植在96孔板上的星形膠質(zhì)細(xì)胞用PBS(0.01 mol·L-1，pH=7.4)，輕柔沖洗3次，每次5 min，然后用4%多聚甲醛固定15 min。3%胎牛血清室溫封閉30 min。滴加一抗(兔抗GFAP，1∶400)，4 ℃過夜。PBS清洗細(xì)胞3次，5 min·次-1，滴加二抗(抗兔的二抗TRITC，1∶800)，避光室溫孵育2 h。Hoechst 33258避光染色10 min，清洗細(xì)胞2次，于熒光顯微鏡(ZEISS)下觀察并拍照。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。

1.5.3 Western Blot檢測(cè)NOX2蛋白表達(dá) Western Blot參照文獻(xiàn)的研究方法[19]。使用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA進(jìn)行蛋白定量，用15%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗(兔抗NOX2多克隆抗體，1∶1 000)，4 ℃過夜。TBST清洗3次，加入二抗(羊抗小鼠單克隆抗體，1∶3 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌后，用化學(xué)發(fā)光顯色法顯影，定影，洗片。用Image J圖像處理軟件分析條帶的灰度值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

星形膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)第9天分化成熟，形成神經(jīng)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。GFAP免疫熒光染色顯示細(xì)胞質(zhì)呈紅色(圖3A)，Hoechst 33258染色顯示細(xì)胞核呈藍(lán)色(圖3B)，胞質(zhì)呈紅色的即為星形膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞純度>98%(圖3C)。

圖3 星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色

2.2 糖氧剝奪對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

缺糖缺氧8 h后，糖氧剝奪組與對(duì)照組比較，細(xì)胞活力變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。缺糖缺氧12 h后，糖氧剝奪組與對(duì)照組比較，細(xì)胞活力下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。缺糖缺氧24 h后，糖氧剝奪組與對(duì)照組比較，細(xì)胞活力明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。缺糖缺氧24 h后細(xì)胞生存率下降最顯著，降至(65.91±8.21)%。見表1。

表1 缺糖缺氧8，12，24 h，星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果

2.3 壯通飲對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

正常培養(yǎng)8 h后，對(duì)照組和不同濃度壯通飲預(yù)處理組之間比較，細(xì)胞活力沒有差異(P>0.05)。正常培養(yǎng)24 h后，壯通飲40 mg·L-1和80 mg·L-1預(yù)處理組與對(duì)照組比較，細(xì)胞活力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 壯通飲對(duì)正常培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞活力影響的測(cè)定結(jié)果

2.4 壯通飲對(duì)糖氧剝奪后不同時(shí)間星形膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

復(fù)氧(再灌注)后0 h，糖氧剝奪組和不同濃度壯通飲預(yù)處理組之間比較，細(xì)胞活力沒有差異(P>0.05)。復(fù)氧后8 h，壯通飲40 mg·L-1和80 mg·L-1預(yù)處理組與糖氧剝奪組比較，細(xì)胞活力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。復(fù)氧后24 h，壯通飲80 mg·L-1預(yù)處理組與糖氧剝奪組比較，細(xì)胞活力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 壯通飲對(duì)復(fù)氧0 h、8 h、24 h星形膠質(zhì)細(xì)胞活力影響的測(cè)定結(jié)果

2.5 壯通飲及夾竹桃麻素對(duì)糖氧剝奪/再灌注誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷中NOX2表達(dá)的影響

Western Blot顯示，復(fù)氧后0 h，糖氧剝奪組星形膠質(zhì)細(xì)胞NOX2表達(dá)水平與對(duì)照組比較升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同濃度三壯通飲預(yù)給藥對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞NOX2表達(dá)的影響與糖氧剝奪組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。復(fù)氧后8 h，糖氧剝奪組星形膠質(zhì)細(xì)胞NOX2表達(dá)水平與對(duì)照組比較升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同濃度壯通飲預(yù)給藥組星形膠質(zhì)細(xì)胞NOX2表達(dá)水平降低，與糖氧剝奪組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果顯示壯通飲對(duì)NOX2表達(dá)起抑制作用。夾竹桃麻素是NOX2的抑制劑，糖氧剝奪后復(fù)氧0 h、8 h，糖氧剝奪組星形膠質(zhì)細(xì)胞NOX2表達(dá)水平與對(duì)照組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。夾竹桃麻素預(yù)給藥組(0.25 mg·mL-1和0.5 mg·mL-1)星型膠質(zhì)細(xì)胞NOX2表達(dá)水平與糖氧剝奪組比較顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

3 討論

表4 壯通飲及夾竹桃麻素對(duì)糖氧剝奪復(fù)氧0 h、8 h星形膠質(zhì)細(xì)胞NOX2表達(dá)影響的測(cè)定結(jié)果

腦卒中是危害人類健康最重要的疾病之一，其中缺血性卒中占所有卒中類型的85%，是致殘和致死的首要和第二位病因[20]。急性缺血性卒中對(duì)腦血流的損害導(dǎo)致了腦缺氧和細(xì)胞凋亡。盡早恢復(fù)腦血流再通對(duì)于急性缺血性卒中患者至關(guān)重要。目前恢復(fù)血流再通的主要治療方法是溶栓，但由于治療時(shí)間窗過短及潛在的出血風(fēng)險(xiǎn)極大限制了其在臨床中的廣泛應(yīng)用[21]。因此，我們迫切需要針對(duì)急性缺血性卒中的新療法。通過干預(yù)腦組織缺血缺氧所引起的一系列生理病理改變，保護(hù)缺血引起的神經(jīng)損傷(即神經(jīng)保護(hù))，對(duì)于缺血性卒中的治療具有極其重要的意義。目前，很多學(xué)者都在嘗試研究通過神經(jīng)保護(hù)減輕或逆轉(zhuǎn)腦缺血的藥物及其制劑[22]。研究證實(shí)壯通飲具有廣泛的藥理作用，包括擴(kuò)張血管、抗氧化、抗凝、降低血液黏稠度、降血糖、改善微循環(huán)、抑制血栓形成等[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示壯通飲能夠提高正常培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞活力，對(duì)糖氧剝奪/再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。結(jié)果顯示正常培養(yǎng)24 h，壯通飲能夠增強(qiáng)細(xì)胞活力，但糖氧剝奪導(dǎo)致細(xì)胞活力下降，其中24 h細(xì)胞活力下降最明顯，說明糖氧剝奪對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞具有損傷作用。而復(fù)氧后8 h和24 h，不同濃度的壯通飲分別能夠增強(qiáng)糖氧剝奪后的細(xì)胞活力，說明壯通飲對(duì)糖氧剝奪造成的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，同時(shí)也表明壯通飲的神經(jīng)保護(hù)作用呈現(xiàn)出劑量依賴的特點(diǎn)。

NADPH氧化酶(NOX)在卒中的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，尤其是NOX2在缺血性卒中的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要角色[24-25]。既往有很多研究已經(jīng)證實(shí)抑制NOX2活性能夠預(yù)防和治療缺血性腦損傷[26-28]。本研究發(fā)現(xiàn)糖氧剝奪增強(qiáng)了NOX2在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，并證實(shí)NOX2在糖氧剝奪導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細(xì)胞缺血性損傷中發(fā)揮了重要作用。壯通飲能夠抑制糖氧剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞中NOX2的表達(dá)，說明壯通飲對(duì)缺血性腦損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，而這種保護(hù)作用正是通過抑制NOX2的活性起作用的。為進(jìn)一步驗(yàn)證壯通飲通過抑制NOX2發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，我們使用夾竹桃麻素這種NOX2抑制劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示夾竹桃麻素能夠抑制糖氧剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞中NOX2的表達(dá)，說明壯通飲能夠發(fā)揮與NOX2抑制劑相同的作用。研究證實(shí)NOX2產(chǎn)生的活性氧(ROS)是體內(nèi)ROS的主要來源，ROS的產(chǎn)生加劇了缺血性腦損傷。我們的研究結(jié)果表明壯通飲通過抑制NOX2的活性發(fā)揮保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞缺血性損傷的作用可能是通過抗氧化機(jī)制來實(shí)現(xiàn)。但還需要更深入的研究來探索壯通飲發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制，并進(jìn)一步在體內(nèi)(動(dòng)物)實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證這些結(jié)果。

綜上所述，壯通飲對(duì)糖氧剝奪誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，這種保護(hù)作用主要是通過抑制細(xì)胞內(nèi)NOX2的活性來實(shí)現(xiàn)的。