王陳龍，邱 峰，操龍斌△，朱天川，曾令恒

1.南方醫(yī)科大學南海醫(yī)院，廣東佛山 528244；2.中山大學附屬第五醫(yī)院，廣東珠海 519000

膿毒癥作為一種由于感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，它是嚴重創(chuàng)傷、燒傷、感染以及外科大手術(shù)常見并發(fā)癥，并且隨著病情進展可能導致患者出現(xiàn)器官功能障礙以及循環(huán)障礙，進一步發(fā)展還可能引起患者膿毒癥休克，危及生命安全，因此研究膿毒癥發(fā)病機制對于掌握患者病情進展情況，挽救患者生命有著重要意義[1-3]。外周血作為人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其單個核細胞既能夠有效反映宿主的免疫情況，又相對容易獲取，因此觀察外周血單個核細胞變化情況對研究膿毒癥的發(fā)展有著重要指導意義[4-5]。隨著近年來醫(yī)學技術(shù)的發(fā)展，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學已經(jīng)成為研究復雜高通量小分子蛋白的主流工具，而數(shù)據(jù)非依賴(DIA)技術(shù)則是通過對所有母離子選擇、碎裂，采集母離子的全部離子信息，能夠大規(guī)模、高通量地做到相對定量和絕對定量。為此，南方醫(yī)科大學南海醫(yī)院以及中山大學附屬第五醫(yī)院基于數(shù)據(jù)非依賴性采集高分辨率色譜-質(zhì)譜技術(shù)(DIA LC-MS)對膿毒癥患者外周血差異蛋白進行研究分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇南方醫(yī)科大學南海醫(yī)院以及中山大學附屬第五醫(yī)院2018年8月至2019年8月重癥監(jiān)護室收治的60例膿毒癥患者作為觀察組，同時將上述兩所醫(yī)院同一時期入住重癥監(jiān)護室的術(shù)后未并發(fā)膿毒癥的60例患者作為對照組。納入標準：(1)患者存在明確感染證據(jù)，序貫器官衰竭評估(SOFA評分)變化≥2；(2)患者家屬知情并簽署同意書。排除標準：(1)患者存在自身免疫疾病；(2)合并嚴重肝、腎功能不全者；(3)患者近半年內(nèi)使用過免疫抑制藥物。觀察組中男33例，女27例；年齡35～79歲，平均(61.5±4.8)歲；肺部感染24例，腹腔感染12例，泌尿系感染15例，其他部位感染19例。對照組中男31例，女29例；年齡34～76歲，平均(61.2±4.7)歲。兩組研究對象在性別、年齡方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1細胞蛋白標本制備 疑似膿毒癥患者在重癥監(jiān)護室發(fā)生高熱后，留取高熱血培養(yǎng)的同時取外周靜脈血5 mL，床邊EDTA管抗凝，于4 h內(nèi)送至實驗室分類提取外周血單個核細胞。

1.2.2質(zhì)譜蛋白標本制備 在BCA法測定患者蛋白水平后取50 μg蛋白，加入6 mol/L尿素反應(yīng)30 min，55 ℃下 加入5 mmol/L TCEP還原反應(yīng)30 min，然后加入碘乙酰胺控制水平為6.25 mmol/L，避光反應(yīng)1 h，加入碳酸氫銨稀釋后再加入1 mmol/L氯化鈣，堿性環(huán)境中使胰酶變性，37 ℃下反應(yīng)16 h，除鹽后冷凍干燥。

1.2.3采集質(zhì)譜數(shù)據(jù) 采用EASY nLC-1000 UPLC系統(tǒng)聯(lián)合Orbitrap質(zhì)譜檢測器Q-Exactive plus質(zhì)譜儀進行數(shù)據(jù)采集，上樣量1 μg，在同一根自制C18分析柱上進行。分離相：A相為0.1%甲酸，B相為0.1%甲酸加80%乙腈，環(huán)境溫度控制在4 ℃。梯度洗脫程序：0～5 min，A相97%～93%，B相3%～7%；>5～55 min，A相93%～78%，B相7%～22%；>55～65 min，A相78%～65%，B相22%～35%；>65～68 min，A相65%～20%，B相35%～80%；>68～75 min，A相20%，B相80%。

1.2.4質(zhì)譜方法 DDA掃描：采用正離子掃描，范圍為400～1 200 m/z，時間75 min。一級掃描模式為全掃描，范圍為400～1 200 m/z，一級檢測軌道分辨率70 000 FWHM@200 m/z；自動增益控制為3×106，最長注射離子時間為50 ms，電荷數(shù)2～7，loop count 20，二級質(zhì)譜碎裂模式HCD，碰撞能量NCE為27%，二級自動增益控制為5×105。DIA數(shù)據(jù)采集：一級掃描模式為全掃描，范圍為400～1 200 m/z，一級檢測軌道分辨率35 000 FWHM@ 200 m/z，AGC為5×105，窗口為32個固定窗口，每個窗口分別為選擇、碎裂、采集母離子和全部子離子信息用于定量。

1.2.5數(shù)據(jù)及生物信息分析 DDA數(shù)據(jù)采用軟件Proteome Discoverer進行搜庫，結(jié)果導入軟件Skyline建庫并進行數(shù)據(jù)分析提取。將篩選出的差異蛋白在DAVID生物信息數(shù)據(jù)庫中作KEGG通路分析、GO分析，從蛋白質(zhì)的生物過程、分子功能、細胞組分進行基因富集分析。

1.2.6蛋白驗證 采用雙抗體夾心酶免疫分析法(ELISA)測定外周血單個核細胞中生物標志物的含量，試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司，操作步驟嚴格按照說明書進行。

2 結(jié) 果

2.1差異蛋白的篩選 兩組患者共獲得530 391個碎片離子，63 378個肽段，7 104個蛋白；60個DIA標本采用Skyline共篩選鑒定得到147 363個碎片離子，21 840個肽段，6 213個蛋白。將碎片離子加和，共得到357個差異蛋白，其中93個高表達，264個低表達。為了更直觀地顯示不同差異蛋白在不同標本間的表達差異，可根據(jù)顯著性差異蛋白表達量在標本間進行層次聚類。

2.2GO分析和通路分析 對這357個差異蛋白進行GO分析顯示，富集最多的細胞組分是細胞外泌體、細胞膜以及細胞質(zhì)，見圖1A；聚類到最多的生物功能是受體介導內(nèi)吞、細胞黏附反應(yīng)以及血小板脫顆粒，見圖1B，這些功能可能與膿毒癥的發(fā)展密切相關(guān)；最多見的分子功能是蛋白結(jié)合、poly(A)RNA結(jié)合、細胞黏附以及鐵離子結(jié)合，見圖1C；在對這些差異蛋白進行KEGG分析后顯示，細菌侵襲上皮細胞、代謝通路、碳代謝通路、血小板激活、補體以及凝血瀑布這幾條通路與膿毒癥的發(fā)展密切相關(guān)，見圖1D。

注：A為細胞組分；B為生物過程；C為分子功能；D為KEGG通路。

2.3差異蛋白的驗證 對357個差異蛋白進行VIP值篩選，共篩選出138個差異蛋白，其中貢獻最大的分別是高遷移率蛋白(HMGB-1)、中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)以及基質(zhì)金屬蛋白酶-8(MMP-8)，在進行ELISA驗證后顯示，觀察組患者HMGB-1、NGAL以及MMP-8表達水平明顯高于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者HMGB-1、NGAL以及MMP-8表達水平比較

2.4ROC曲線診斷模型 將兩組患者外周血單個核細胞進行ELISA檢測后建立ROC曲線診斷模型顯示，HMGB-1靈敏度為0.832，特異度為0.865；NGAL靈敏度為0.802，特異度為0.668；MMP-8靈敏度為0.833，特異度為0.866。

3 討 論

目前膿毒癥的發(fā)病機制尚不明確，但是臨床研究顯示免疫紊亂是膿毒癥發(fā)病的關(guān)鍵因素[6-7]?；颊咭坏┌l(fā)病后病情進展迅速，臨床救治困難，這也是導致危重癥患者死亡的首要因素，研究顯示并發(fā)心肌損害更嚴重影響到患者臨床預后，近40%的患者會出現(xiàn)不同程度的心肌損害，尤其是在新生兒敗血癥中更易出現(xiàn)，一旦出現(xiàn)心血管并發(fā)癥，患者病情就會急劇惡化，病死率可上升至70%～90%，因此了解膿毒癥的發(fā)病機制對于挽救患者生命安全有著重要意義[8]。

本研究顯示，在對兩組患者檢測后共獲得530 391個碎片離子，63 378個肽段，7 104個蛋白；60個DIA標本采用Skyline共篩選鑒定得到147 363個碎片離子，21 840個肽段，6 213個蛋白。將碎片離子加和，共得到357個差異蛋白，其中93個高表達，264個低表達。正是這些蛋白的生物作用引發(fā)了促炎因子的釋放，加劇了患者膿毒癥的進展，因此通過蛋白質(zhì)組學的方法可以更加直觀地了解膿毒癥的發(fā)病機制[9-10]。

研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥的發(fā)展與多種通路有關(guān)，免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)紊亂導致機體嚴重感染應(yīng)答失調(diào)，免疫調(diào)控由過度的免疫激活進展至致死性免疫抑制。在對357個差異蛋白進行GO分析顯示，富集最多的細胞組分是細胞外泌體、細胞膜以及細胞質(zhì)；聚類到最多的生物功能是受體介導內(nèi)吞、細胞黏附反應(yīng)以及血小板脫顆粒，這些功能可能與膿毒癥的發(fā)展密切相關(guān)。最多見的分子功能是蛋白結(jié)合、poly(A)RNA結(jié)合、細胞黏附以及鐵離子結(jié)合。在對這些差異蛋白進行KEGG分析后顯示，細菌侵襲上皮細胞、代謝通路、碳代謝通路、血小板激活、補體以及凝血瀑布這幾條通路與膿毒癥的發(fā)展密切相關(guān)[11-12]。而HMGB-1作為一種晚期炎癥遞質(zhì)，它的主動分泌和被動釋放能夠誘發(fā)患者出現(xiàn)局部炎癥，激發(fā)細胞因子超表達，加劇炎性反應(yīng)。而凋亡細胞的二次壞死釋放HMGB-1能夠級聯(lián)加劇單核/巨噬細胞的致炎反應(yīng)，因此膿毒癥患者外周血單核細胞HMGB-1的高表達可能與免疫細胞炎癥的啟動與維持，以及炎癥放大的級聯(lián)反應(yīng)存在密切聯(lián)系。NGAL作為急性腎損傷的生物標志物之一，它由肝臟細胞和免疫細胞分泌，與細菌生長和組織分化有密切關(guān)系，NGAL的升高可能與宿主感染細菌時自身免疫抗菌作用有關(guān)。MMP-8在正常情況下水平極低，它能夠激活巨噬細胞中NF-κB 促炎性轉(zhuǎn)錄因子，炎癥條件下MMP-8表達的升高導致患者組織的破壞[13-14]。本研究顯示，對357個差異蛋白進行VIP值篩選，共篩選出138個差異蛋白，其中貢獻最大的分別是HMGB-1、NGAL以及MMP-8，在進行ELISA驗證后顯示，膿毒癥患者HMGB-1、NGAL以及MMP-8表達水平明顯高于非膿毒癥患者，并且HMGB-1靈敏度為0.832、特異度為0.865，NGAL靈敏度為0.802、特異度為0.668，MMP-8靈敏度為0.833、特異度為0.866，對患者臨床診治具有一定指導意義。

綜上所述，基于DIA LC-MS技術(shù)對膿毒癥患者外周血差異蛋白進行研究后顯示，PLS-DA、OPLS-DA以及PCA模式能夠分析蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)，初步篩選出HMGB-1、NGAL以及MMP-8作為膿毒癥患者外周血單個核細胞的候選生物標志物。