郭月山，陳 鋼*，王瑞琪，簡素平，黃立山

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

番茄紅素是一種能夠中和多種氧化因子[1-2]的天然類胡蘿卜素[3]。研究發(fā)現(xiàn)番茄紅素對(duì)多種癌細(xì)胞[4-6]有抑制作用，并能防止人體胞內(nèi)基因突變[7]。這些特性使番茄紅素在保健食品領(lǐng)域有很廣闊的市場。

番茄紅素的3種來源為直接提取[8]、化學(xué)合成[9]和微生物發(fā)酵[10]。粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）作為一種常見真菌，其具有較高的產(chǎn)番茄紅素能力[11-12]，且不像三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）需要接種正負(fù)菌[13]，操作簡便，有作為工業(yè)發(fā)酵菌種的潛力。培養(yǎng)基成分對(duì)微生物發(fā)酵有很大影響，微生物生長情況及發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量因?yàn)槠浣M成成分的不同而變化。碳源、氮源、金屬離子等都對(duì)微生物發(fā)酵有影響[14-15]，而氮源的選擇與添加時(shí)間均對(duì)微生物發(fā)酵有明顯的影響。研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的氨基酸添加、植物性氮源代替動(dòng)物性氮源等對(duì)氮源的改變都能夠不同程度的提高微生物次級(jí)產(chǎn)物的產(chǎn)量。三孢布拉氏霉（Blakesleatrispora）菌培養(yǎng)過程中，加入一定量氨基酸可以顯著增加番茄紅素產(chǎn)量[16]；王蓉等[17]研究發(fā)現(xiàn)不同的無機(jī)氮源可提高黏性紅酵母產(chǎn)番茄紅素產(chǎn)量；植物性氮源對(duì)肺炎雙球菌[18]、乳酸菌[19]的生長均有促進(jìn)作用且植物蛋白相較于動(dòng)物蛋白對(duì)某些微生物有更好的生長促進(jìn)作用；分別對(duì)檸檬酸、ε-聚賴氨酸[20-21]發(fā)酵生產(chǎn)過程的研究證實(shí)，在發(fā)酵過程中添加相應(yīng)氮源能有效提高產(chǎn)量。本研究研究了大豆蛋白胨在粗糙脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素過程中的影響，并對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，為粗糙脈孢菌發(fā)酵高產(chǎn)番茄紅素的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）3.1607，在-20 ℃下保藏于實(shí)驗(yàn)室冰柜，采購于廣東微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

谷氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、精氨酸、亮氨酸（均為分析純）、乙酸乙酯、丙酮色、乙腈、二氯甲烷（均為色譜純）：西隴科學(xué)股份有限公司；番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：上海阿拉丁生化科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：即馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出粉12 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂14 g/L，pH 5.6。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖18 g/L，蛋白胨12 g/L，NaNO31.8 g/L，MgSO4·7H2O 0.24 g/L，KCl 0.3 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.006 g/L，K2HPO40.6 g/L，加蒸餾水制成1 L培養(yǎng)液，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

TS-1210B型恒溫?fù)u床：蘇州市國飛實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；SW-CJ-1B標(biāo)準(zhǔn)凈化工作臺(tái)：蘇州凈化儀器廠；LC-100型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國Agilent公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌體懸液制備

將100 mL蒸餾水的錐形瓶滅菌后接入30 ℃馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基活化的孢子，制成6×105CFU/mL的孢子懸液，置于無菌操作臺(tái)中備用。

1.3.2 搖瓶培養(yǎng)[22]

將50 mL培養(yǎng)基置于錐形瓶，接入菌懸液，移入搖床培養(yǎng)箱中100 r/min培育19 h，后靜置培養(yǎng)87 h，共培養(yǎng)106 h，全程光照，溫度恒定在30 ℃，每次進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，所有試驗(yàn)均以該條件培養(yǎng)。

1.3.3 生物量測定

將菌體從錐形瓶中取出，蒸餾水沖洗后抽濾，獲得的菌體于烘箱中50 ℃下烘干48 h至質(zhì)量恒定，使用分析天平稱量。

1.3.4 番茄紅素的測定

番茄紅素提取[23]：細(xì)磨加入了石英砂的干燥菌體，置入10 mL乙酸乙酯-丙酮溶液（2∶3，V/V），于200 W，40 kz，30 ℃超聲處理20 min后在33 ℃水浴鍋中暗室浸提2.5 h。上層清液以6 000 r/min離心10 min，經(jīng)過0.22 μm濾膜去除雜質(zhì)即可，每組制備3個(gè)平行組，進(jìn)行HPLC檢測。

HPLC色譜檢測條件[24]：色譜柱為Agilent Ecllpse Plus C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm），流動(dòng)相采用乙腈-二氯甲烷（3∶2，V/V），檢測波長472 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

制作番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線[25]：以乙酸乙酯-丙酮溶液（2∶3，V/V）為溶劑，稱取番茄紅素標(biāo)品制備質(zhì)量濃度為100 μg/mL的溶液。稀釋溶液為0、10 μg/mL、30 μg/mL、50 μg/mL、70 μg/mL、90 μg/mL、100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以色譜條件作定性分析，得到各個(gè)梯度的吸收峰面積，以質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)（Y），峰面積為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸計(jì)算，得到番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程：Y=24.933X+10.719（R2=0.9987）。

1.3.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

大豆蛋白胨添加量：在加入大豆蛋白胨、添加時(shí)間為53 h、接種量6%的條件下，探究添加量分別為0、2 g/L、6 g/L、10 g/L、14 g/L、18 g/L時(shí)對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響。

大豆蛋白胨添加時(shí)間：在加入大豆蛋白胨10 g/L、接種量為6%的條件下，探究大豆蛋白胨添加時(shí)間分別為11 h、25 h、39 h、53 h、67 h對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響。

菌種接種量：在加入大豆蛋白胨10 g/L、接種時(shí)間為6%的條件下，探究接入2%、3%、4%、5%、6%、7%的菌種時(shí)對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以大豆蛋白胨添加量（A）、添加時(shí)間（B）、接種量（C）為自變量，番茄紅素產(chǎn)量（D）為響應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)（response surface methodology，RSM）設(shè)計(jì)，RSM因素與水平見表1。

表1 蛋白胨添加條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for peptone addition conditions optimization

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

Design Expert 8.0.6軟件分析數(shù)據(jù)，所得結(jié)果均為3次平行測定均值，Origin 8.5制作單因素試驗(yàn)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 大豆蛋白胨添加量優(yōu)化

圖1 大豆蛋白胨添加量對(duì)粗糙脈孢菌產(chǎn)番茄紅素的影響Fig.1 Effect of soybean peptone addition on lycopene yield by Neurospora crasa

由圖1可知，添加了大豆蛋白胨后，粗糙脈孢菌的干質(zhì)量和番茄紅素產(chǎn)量都有一個(gè)明顯的提高。干質(zhì)量隨著添加量的增加而增加，說明大豆蛋白胨促進(jìn)了菌體的發(fā)育。當(dāng)添加量達(dá)到6 g/L時(shí)菌體干質(zhì)量增加明顯放緩，可能是因?yàn)榇藭r(shí)菌體密度過于稠密，限制了菌體的繼續(xù)發(fā)育，從而導(dǎo)致干質(zhì)量增長放緩。番茄紅素產(chǎn)量隨大豆蛋白胨的量增加而獲得提升，為10 g/L時(shí)達(dá)到頂峰；在大豆蛋白胨＞10 g/L時(shí)產(chǎn)量降低，產(chǎn)量隨大豆蛋白胨的增加而減少，一方面可能是因?yàn)殒咦由L減緩，擴(kuò)增受到限制，另一方面可能是因?yàn)榇蠖沟鞍纂诉^量，分解的肽段過多促進(jìn)了菌體菌絲的生長，造成了光的誘導(dǎo)作用減弱，造成了產(chǎn)量下降。故蛋白胨最佳添加量為10 g/L。

2.1.2 大豆蛋白胨添加時(shí)間優(yōu)化

圖2 大豆蛋白胨添加時(shí)間對(duì)粗糙脈孢菌產(chǎn)番茄紅素的影響Fig.2 Effect of soybean peptone addition time on lycopene yield by Neurospora crasa

由圖2可知，在39 h之前，粗糙脈孢菌干質(zhì)量隨大豆蛋白胨添加時(shí)間的增加而相應(yīng)提高，當(dāng)?shù)竭_(dá)39 h時(shí)干質(zhì)量達(dá)到頂峰，之后干質(zhì)量隨著添加時(shí)間的增加而減少。這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)的11～53 h期間是粗糙脈孢菌的對(duì)數(shù)生長期，此時(shí)加入大豆蛋白胨主要為粗糙脈孢菌補(bǔ)充菌體生長發(fā)育所需的肽段[26]，促進(jìn)粗糙脈孢菌的快速增殖，增加干質(zhì)量。在53 h之前，番茄紅素的產(chǎn)量隨著添加時(shí)間的增加而相應(yīng)提高。添加時(shí)間為53 h時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到峰值，之后產(chǎn)量下降。可能因?yàn)?3 h左右時(shí)菌體開始進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)次級(jí)產(chǎn)物開始大量合成，這時(shí)加入的大豆蛋白胨主要為菌體提供了必要的氨基酸等合成次級(jí)產(chǎn)物的基礎(chǔ)物質(zhì)，促進(jìn)了次級(jí)代謝產(chǎn)物番茄紅素的合成，因此產(chǎn)量也增加。在53 h之后加入大豆蛋白胨，因?yàn)橐延蟹鸭t素的影響同時(shí)有的番茄紅素開始合成β-胡蘿卜素這一下級(jí)產(chǎn)物，添加后番茄紅素前體的增多相應(yīng)促進(jìn)了下一級(jí)產(chǎn)物的合成，因此產(chǎn)量減少。故大豆蛋白胨的最佳添加時(shí)間為53 h。

2.1.3 菌種接種量優(yōu)化

由圖3可知，粗糙脈孢菌的干質(zhì)量隨著接種量的增大而先升高后降低。接種量5%時(shí)，干質(zhì)量達(dá)到峰值，可以看出菌體干質(zhì)量受到的影響有限，可能是因?yàn)樗缅F心瓶容積有限，生長時(shí)菌體受空間限制無法更多生長。接種量＜6%時(shí)產(chǎn)量隨接種量增加而提高，之后下降，可能因?yàn)榻臃N量＞6%時(shí)，菌絲生長過于茂盛，使培養(yǎng)液的渾濁度過高，影響了光照對(duì)菌體番茄紅素的誘導(dǎo)作用最終導(dǎo)致產(chǎn)量的下降。故最佳接種量為6%。

圖3 接種量對(duì)粗糙脈孢菌產(chǎn)番茄紅素的影響Fig.3 Effect of inoculum on lycopene yield by Neurospora crasa

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化大豆蛋白胨添加條件

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)2.1中所得試驗(yàn)結(jié)果，以大豆蛋白胨添加量（A）、添加時(shí)間（B）和菌種接種量（C）作為自變量，番茄紅素產(chǎn)量（D）作為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 大豆蛋白胨添加條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology for soybean peptone addition conditions optimization

2.2.2 模型建立與方差分析

對(duì)表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理分析，最后得到了響應(yīng)值番茄紅素產(chǎn)量（D）對(duì)編碼自變量A、B、C的方程預(yù)測模型為：

方差分析結(jié)果見表3。結(jié)果中的F值大小及P值大小表示表2結(jié)果數(shù)據(jù)是否顯著。一般來說，F(xiàn)值越大，對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)越顯著；P值越小，對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)越顯著。如表3所示，模型的F值為141.50（P＜0.0001），具有非常高的顯著性，同時(shí)可以看到，失擬項(xiàng)的F值為1.84（P＞0.05）表現(xiàn)為不顯著，說明模型不能使用的可能性低，模型良好。模型決定系數(shù)R2=0.9945，表示模型變化來源于自變量的比例，表明模型響應(yīng)值的變化99.45%來自所選自變量，另外存在0.55%的總變異無法采用此模型解釋，極低的變異比例說明模型能較好的解釋結(jié)果。校正決定系數(shù)R2adj=0.987 5，信噪比=34.02＞4，說明模型擬合度良好。其中因素A和B、二次項(xiàng)A2、B2對(duì)產(chǎn)量影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AB對(duì)產(chǎn)量影響顯著（P＜0.05）。由系數(shù)值A(chǔ)=0.64，B=0.26，C=0.059，可知因素的主效應(yīng)關(guān)系為：大豆蛋白胨添加量＞添加時(shí)間＞接種量。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology results

2.2.3 各因素間相互作用

如圖4a所示，大豆蛋白胨添加量和添加時(shí)間之間對(duì)粗糙脈孢菌番茄紅素產(chǎn)量影響顯著，存在最高點(diǎn)[27]，即大豆蛋白胨添加量在10～12 g/L之間、添加時(shí)間在53～60 h之間時(shí)，番茄紅素的產(chǎn)量達(dá)到最高。而觀察圖4b、4c可以明顯發(fā)現(xiàn)AC、BC的響應(yīng)面圖不形成閉環(huán)，且從表3可以發(fā)現(xiàn)，兩者P值均＞0.05，其交互作用不顯著。依據(jù)所得數(shù)據(jù)，結(jié)合已計(jì)算出的實(shí)驗(yàn)方程，分析獲得的最佳發(fā)酵條件如下：大豆蛋白胨添加量10.80 g/L，添加時(shí)間55.27 h，接種量6.17%，添加后培養(yǎng)50.73 h，預(yù)測番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到最大值9.65 mg/L。

圖4 各因素交互作用對(duì)番茄紅素產(chǎn)量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on lycopene yield

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了便于實(shí)際操作，將理論最佳發(fā)酵條件修正為：大豆蛋白胨添加量11 g/L，添加時(shí)間55 h，接種量為6%，添加蛋白胨后繼續(xù)培養(yǎng)51 h。經(jīng)過3次重復(fù)試驗(yàn)檢驗(yàn)，獲得的番茄紅素產(chǎn)量實(shí)際值為（9.64±0.15）mg/L，此結(jié)果與預(yù)測值基本吻合，沒有明顯差異。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了大豆蛋白胨對(duì)粗糙脈孢菌產(chǎn)番茄紅素的影響，確定了大豆蛋白胨對(duì)粗糙脈孢菌產(chǎn)番茄紅素有明顯影響。結(jié)合單因素與響應(yīng)面法優(yōu)化了大豆蛋白胨添加量、添加時(shí)間及菌種接種量因素，影響因素順序依次為：大豆蛋白胨添加量＞添加時(shí)間＞接種量。最佳發(fā)酵工藝條件為：大豆蛋白胨添加量11 g/L，添加時(shí)間55 h，接種量6%，添加蛋白胨后繼續(xù)培養(yǎng)51 h。此優(yōu)化條件下，番茄紅素的產(chǎn)量為9.64 mg/L。