孫朝陽(yáng)，張玉英，潘利華，楊思林，魏春廳，羅建平*

（1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽省華信生物藥業(yè)股份有限公司，安徽 界首 236502）

硒是人體所必需的微量元素，機(jī)體長(zhǎng)期缺硒會(huì)導(dǎo)致克山病、糖尿病、大骨節(jié)病、心腦血管病、神經(jīng)退行性疾病等多種疾病的發(fā)生[1]。自然界中硒以無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒的形式存在，與無(wú)機(jī)硒相比，有機(jī)硒的生物利用率高，易于動(dòng)物吸收利用，且毒性低，適量補(bǔ)充有機(jī)硒對(duì)人體健康極為重要[2-3]。硒酵母是目前應(yīng)用最為廣泛的一種食品級(jí)有機(jī)硒補(bǔ)充劑[4]，由酵母在生長(zhǎng)過(guò)程中將外源無(wú)機(jī)態(tài)的硒轉(zhuǎn)化為菌體有機(jī)態(tài)的硒而獲得，其核心品質(zhì)是富含高水平的有機(jī)硒[5-6]。因此，篩選出高水平將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的富硒酵母菌株對(duì)富硒酵母的生產(chǎn)至關(guān)重要。

目前，富硒酵母菌株的篩選國(guó)內(nèi)外都是采用含高濃度無(wú)機(jī)硒的培養(yǎng)基直接對(duì)自然來(lái)源的菌株或物理化學(xué)誘變的菌株進(jìn)行馴化分離以獲得目的菌株[7-9]，所分離出的菌株常常表現(xiàn)出在高濃度無(wú)機(jī)硒下生長(zhǎng)良好，但有機(jī)硒積累水平不高的現(xiàn)象[10]，從而增加反復(fù)篩選的工作強(qiáng)度[11-12]，且極少探討菌株富硒能力與有機(jī)硒合成相關(guān)酶表達(dá)的關(guān)系。在富硒酵母中，硒蛋白是有機(jī)硒的一種主要存在形式，其含量高低不僅是富硒酵母品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，同時(shí)也反映出富硒酵母將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的能力[13]。大量研究揭示，在硒蛋白的生物合成中，硒磷酸合成酶（selenophosphate synthetase，SPS）為限速酶，它在腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的參與下催化無(wú)機(jī)硒生成硒代磷酸，由于硒代磷酸是硒蛋白合成的活性硒供體，所以SPS催化硒代磷酸生成的活性高低決定了硒蛋白的合成水平[14-16]。有研究表明，SPS對(duì)H2O2敏感，一定濃度的H2O2可顯著抑制SPS活性，進(jìn)而抑制硒代磷酸的生成和硒蛋白的合成，降低細(xì)胞富集有機(jī)硒的能力[15-16]。因此，本研究將以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為出發(fā)菌株、以H2O2為選擇壓力進(jìn)行高富硒酵母菌株的誘變篩選和富硒特性分析，以期為富硒酵母的選育提供新的思路，為富硒酵母的生產(chǎn)提供優(yōu)良的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（館藏號(hào)：1412）。

1.1.2 化學(xué)試劑

Na2SeO3、NaN3、Na2MoO4、NaOH、甲酸、濃氨水、甲苯、濃硫酸、高氯酸：上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；H2O2：廣東恒健制藥有限公司；鹽酸羥胺、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）-2Na：上海陽(yáng)光生物科技有限公司；3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（3,3'-diaminobenzidine，DAB）：華中海威（北京）基因科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；酵母蛋白提取試劑盒：江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；微生物硒磷酸合成酶SeP酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）試劑盒：上海酶聯(lián)生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純和生化試劑。

1.1.3 化學(xué)試劑

液體培養(yǎng)基：麥芽膏粉130 g/L、氯霉素0.1 g/L，121 ℃滅菌20 min。

固體培養(yǎng)基：麥芽膏粉130 g/L、氯霉素0.1 g/L、瓊脂15 g/L，培養(yǎng)基使用時(shí)加入定量蒸餾水溶解、調(diào)節(jié)pH分別至pH 5.6±0.2和pH 6.0±0.2，經(jīng)121 ℃滅菌20 min[17]。

1.2 儀器與設(shè)備

HQ45Z恒溫?fù)u床：中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；SKP-02電熱恒溫培養(yǎng)箱：湖北省黃石市醫(yī)療器械廠；DGF30/7-I電熱鼓風(fēng)干燥箱：南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；V1100可見(jiàn)光分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；CT15RT高速冷凍離心機(jī)：上海天美科學(xué)儀器有限公司；MDF-U73V超低溫冰箱、MLS-3750高壓滅菌鍋：日本SANYO公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化與搖瓶培養(yǎng)

菌種固體斜面活化24 h后，挑取一環(huán)于裝液量為50 mL/250 mL麥芽汁液體培養(yǎng)基搖瓶中，在28 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h作為活化的菌種。取活化的菌種以10%的接種量接種到裝液量為50 mL/250 mL搖瓶中振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28 ℃，振蕩轉(zhuǎn)速為180 r/min[18]。

1.3.2 菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

采取分光光度法測(cè)定菌種的生長(zhǎng)曲線?；罨木N在搖瓶培養(yǎng)過(guò)程中每隔4 h于波長(zhǎng)560 nm條件下測(cè)定培養(yǎng)液的OD560nm值，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線[19]。

1.3.3 NaN3和H2O2處理?xiàng)l件的確定

活化的出發(fā)菌株經(jīng)搖瓶培養(yǎng)至6 h時(shí)，取培養(yǎng)液加入終濃度為10 moL/L的NaN3，分別誘變處理0、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min后，8 000 r/min離心10 min，棄上清并經(jīng)無(wú)菌蒸餾水離心洗滌兩次，取誘變的菌體轉(zhuǎn)入50 mL無(wú)菌水的搖瓶中振蕩20 min（28 ℃、180 r/min），用涂片計(jì)數(shù)法在顯微鏡下計(jì)數(shù)并調(diào)整菌懸液至相同的濃度。取上述菌懸液1 mL按照10倍稀釋法逐級(jí)稀釋至10-3，取該菌懸液0.1 mL移入平板培養(yǎng)基上，無(wú)菌玻璃棒涂布，在28 ℃下靜置培養(yǎng)48 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算誘變處理后的每mL菌液內(nèi)的活菌數(shù)，確定NaN3的誘變條件。

取經(jīng)搖瓶培養(yǎng)6 h的出發(fā)菌株，分別加入1 mL含量為0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%的H2O2后繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，同前法測(cè)定菌體的生長(zhǎng)，確定H2O2的篩選條件。

1.3.4 菌株的誘變與篩選

活化的出發(fā)菌株經(jīng)搖瓶培養(yǎng)至6 h時(shí)，加入終濃度為10 mol/L的NaN3誘變處理40 min，經(jīng)無(wú)菌蒸餾水離心洗滌2次后，轉(zhuǎn)入新的液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)（28 ℃、180 r/min）6 h，加入1 mL含量為2.50%的H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，再經(jīng)無(wú)菌蒸餾水離心洗滌2次，用50 mL無(wú)菌蒸餾水振蕩20 min，制備菌懸液；取菌懸液1 mL按照10倍稀釋法逐級(jí)稀釋至10-3，取稀釋的菌懸液0.1 mL移入平板培養(yǎng)基上，無(wú)菌玻璃棒涂布后，在28 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h，獲得存活菌株的單菌落。挑取單菌落用2.50%～3.00%的H2O2進(jìn)行復(fù)篩，并在加入1 mL H2O2（2.50%）的搖瓶中連續(xù)傳代培養(yǎng)6次，進(jìn)行菌株的H2O2耐受穩(wěn)定性測(cè)定。

1.3.5 菌株的富硒培養(yǎng)

將活化的出發(fā)菌種、誘變菌種搖瓶培養(yǎng)，分別在6 h時(shí)加入終質(zhì)量濃度為25 μg/mL的Na2SeO3溶液，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，取酵母培養(yǎng)液于8 000 r/min下離心10 min收集菌體，用去離子水離心洗滌2～3次后，菌體于60 ℃烘干至恒質(zhì)量，留待測(cè)定硒的含量[20]。

1.3.6 硒的測(cè)定

樣品中總硒和無(wú)機(jī)硒的測(cè)定按文獻(xiàn)方法進(jìn)行，有機(jī)硒為總硒中減去無(wú)機(jī)硒的含量[21]。蛋白硒含量測(cè)定時(shí)，按照文獻(xiàn)的方法[13]，取干燥的樣品加入定量的去離子水，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至11，冰浴超聲2 h、37 ℃條件下振蕩保溫2 h后，于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清加硫酸銨至飽和，經(jīng)4 ℃過(guò)夜、離心取沉淀、透析、冷凍干燥得蛋白樣品，同前法測(cè)定樣品中總硒的含量，計(jì)算每克蛋白的硒含量。

1.3.7 硒磷酸合成酶活性的測(cè)定

將活化的出發(fā)菌種、誘變菌種搖瓶培養(yǎng)，分別在6 h時(shí)加入終質(zhì)量濃度為25 μg/mL的Na2SeO3溶液后繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中，定時(shí)取酵母培養(yǎng)液，采用酵母蛋白提取試劑盒提取酵母蛋白、BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量、微生物硒磷酸合成酶SeP試劑盒測(cè)定硒磷酸合成酶活性。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 8.6軟件繪制圖表，利用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，應(yīng)用One-way方差分析（anaylsis of variance，ANOVA）比較不同試驗(yàn)組間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變與篩選條件的確定

2.1.1 菌株生長(zhǎng)曲線

圖1 出發(fā)菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of the starting strain

由圖1可知，將活化的出發(fā)菌株接入未加硒的液體培養(yǎng)基中振動(dòng)培養(yǎng)，在0～4 h期間菌株生長(zhǎng)緩慢，為滯緩期；4～16 h菌株生長(zhǎng)加快，菌體濃度快速增加，為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；16～48 h菌體濃度基本保持不變，為穩(wěn)定期。因此，選擇生長(zhǎng)6 h的出發(fā)菌株進(jìn)行誘變和篩選。

2.1.2 NaN3誘變處理

NaN3是一種引發(fā)基因點(diǎn)突變的化學(xué)誘變劑，誘變譜帶寬、誘變效率高[22]，本研究采用NaN3對(duì)酵母菌株進(jìn)行誘變，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，當(dāng)固定NaN3終濃度為10 μmol/L時(shí)，隨著NaN3誘變時(shí)間的增加，菌株的存活率相應(yīng)逐漸下降，當(dāng)誘變時(shí)間為40 min時(shí)，菌株的致死率接近80%，再增加誘變時(shí)間菌體的存活率很低將不利于篩選。因此，采用終濃度為10 μmol/L的NaN3溶液處理菌株40 min為誘變條件。

圖2 NaN3誘變處理對(duì)菌株存活的影響Fig.2 Effect of NaN3 mutagenize on the strain survival

2.1.3 H2O2處理誘變處理

圖3 H2O2處理對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of H2O2 treatment on the strain growth

由圖3可知，出發(fā)菌株對(duì)低濃度的H2O2具有一定的耐受，當(dāng)加入H2O2濃度在0.50%～0.75%時(shí)，菌株的生長(zhǎng)急劇下降，H2O2濃度達(dá)到0.75%，菌株的生長(zhǎng)僅有未處理菌株的10.8%，當(dāng)H2O2濃度＞2.00%時(shí)，菌株全部死亡，因此確定2.50%的H2O2濃度為菌株生長(zhǎng)的致死濃度。因此，選擇2.50%的H2O2作為選擇壓力對(duì)誘變后的菌株進(jìn)行篩選。

2.2 富硒酵母菌株的篩選與鑒定

2.2.1 富硒酵母菌株的初篩

搖瓶培養(yǎng)6 h的出發(fā)菌株用10 μmol/L NaN3溶液誘變處理40 min后，經(jīng)搖瓶恢復(fù)培養(yǎng)、2.50%的H2O2篩選和平板涂布培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，可得到兩個(gè)單菌落，而未經(jīng)誘變的出發(fā)菌株經(jīng)H2O2篩選、平板涂布培養(yǎng)未見(jiàn)生長(zhǎng)的菌落。

圖4 平板培養(yǎng)基上的菌株初篩結(jié)果Fig.4 Primary screening results of strain growth on plate medium

2.2.2 富硒酵母菌株的復(fù)篩及抗性穩(wěn)定性

將初篩獲得的兩個(gè)菌株分別命名為HXS-01和HXS-02，進(jìn)行H2O2復(fù)篩，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5A可知，兩個(gè)菌落在H2O2加入濃度為2.50%～3.00%的搖瓶中生長(zhǎng)良好，與無(wú)H2O2存在的搖瓶培養(yǎng)相比，它們的生長(zhǎng)僅有10%～20%的下降，表明這兩個(gè)菌落對(duì)致死濃度（2.50%）的H2O2具有抗性，且對(duì)更高濃度（3.00%）的H2O2具有較好的耐受。由圖5B可知，在含H2O2的搖瓶中進(jìn)行連續(xù)6次的傳代培養(yǎng)，結(jié)果表明其對(duì)致死濃度（2.50%）的H2O2具有穩(wěn)定的抗性。

圖5 篩選菌株對(duì)不同H2O2濃度的耐受性（A）及傳代穩(wěn)定性（B）Fig.5 Tolerance of screened strains to different H2O2 concentrations(A) and genetics stability (B)

2.2.3 富硒酵母菌株的富硒特性

為了鑒定篩選出的菌株是否具有高富硒能力，將出發(fā)菌株和HXS-01、HXS-02菌株分別進(jìn)行搖瓶富硒培養(yǎng)，48 h后收集菌體，測(cè)定菌體的生物量、總硒及有機(jī)硒含量與產(chǎn)率，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，與出發(fā)菌株相比，菌株HXS-01和HXS-02在含Na2SeO3的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)相對(duì)較慢，培養(yǎng)48 h后兩者的生物量分別是出發(fā)菌株的88.8%和89.6%，但它們的總硒含量及總硒產(chǎn)率均顯著高于出發(fā)菌株（P＜0.05），菌株HXS-01和HXS-02的總硒含量分別是出發(fā)菌株的4.4倍和4.7倍、總硒產(chǎn)率分別是出發(fā)菌株的3.9倍和4.2倍，并且菌株HXS-01和HXS-02的有機(jī)硒轉(zhuǎn)化能力較高，兩者的有機(jī)硒含量分別是出發(fā)菌株的4.7倍和5.0倍、有機(jī)硒產(chǎn)率分別是出發(fā)菌株的4.1倍和4.5倍，有機(jī)硒占總硒的百分比均超過(guò)97.5%，而出發(fā)菌株有機(jī)硒占總硒的百分比僅為92.6%。結(jié)果顯示，以NaN3為誘變劑、H2O2為選擇壓力可以有效篩選出高富硒能力的酵母菌株，所篩選出的菌株HXS-01和HXS-02無(wú)論是總硒、有機(jī)硒含量方面，還是總硒、有機(jī)硒產(chǎn)率方面都優(yōu)于出發(fā)菌株，且菌株HXS-02富硒及有機(jī)硒轉(zhuǎn)化能力優(yōu)于菌株HXS-01。

表1 出發(fā)菌株與菌株HXS-01及HXS-02的富硒能力比較Table 1 Comparison on selenium enrichment potential between the original strain,strain HXS-01 and HXS-02

2.2.4 富硒酵母菌株的富硒穩(wěn)定性分析

圖6 出發(fā)菌株與菌株HXS-01及HXS-02的富硒能力穩(wěn)定性比較Fig.6 Comparison of the stability of selenium-enriched ability of the original,strains HXS-01 and HXS-02

將菌株HXS-01和HXS-02在含Na2SeO3的培養(yǎng)基中進(jìn)行連續(xù)6代搖瓶培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，兩個(gè)菌株的干質(zhì)量（見(jiàn)圖6A）、菌體的總硒含量（見(jiàn)圖6B）和總硒產(chǎn)率（見(jiàn)圖6C）均保持較好的穩(wěn)定性，有機(jī)硒占總硒的百分比穩(wěn)定在97%以上（見(jiàn)圖6D），而出發(fā)菌株雖然生長(zhǎng)高于菌株HXS-01和HXS-02，但其總硒含量和總硒產(chǎn)率遠(yuǎn)低于菌株HXS-01和HXS-02，且有機(jī)硒占總硒的百分比一直維持在92%左右。6次連續(xù)傳代培養(yǎng)后，菌株HXS-01和HXS-02的平均總硒含量、有機(jī)硒含量、總硒產(chǎn)率、有機(jī)硒產(chǎn)率分別是2 138.68 μg/g和2 290.74 μg/g、2 195.11 μg/g和2 236.49 μg/g、7155.22μg/L和7606.98μg/L以及7009.47μg/L和7426.77μg/L，為出發(fā)菌株的3.9～5.2倍。結(jié)果表明，菌株HXS-01和HXS-02具有穩(wěn)定的高富硒和高有機(jī)硒轉(zhuǎn)化的能力。

2.3 富硒酵母菌株的SPS活性和蛋白硒含量分析

圖7 菌株HXS-01和HXS-02硒磷酸合成酶活性（A）及蛋白硒的含量（B）Fig.7 Activities of selenophosphate synthetase (A) and contents of selenium in proteins(B)of strains HXS-01 and HXS-02 strains

由圖7A可知，在搖瓶富硒培養(yǎng)階段，出發(fā)菌株和菌株HXS-01、HXS-02的SPS活性呈現(xiàn)相似的緩慢增加趨勢(shì)，菌株HXS-01和HXS-02的SPS活性均顯著高于出發(fā)菌株，且菌株HXS-02的SPS活性總體上高于菌株HXS-01。由圖7B可知，菌株HXS-01、HXS-02的搖瓶富硒培養(yǎng)后的菌體蛋白硒含量分別是出發(fā)菌株的1.9倍和2.1倍。結(jié)果表明，經(jīng)H2O2篩選出的誘變菌株具有高SPS活性，由于SPS為硒蛋白生物合成的限速酶，因此可以推測(cè)高SPS活性賦予了誘變菌株具有高水平的蛋白硒合成能力[10，15-16]。

3 結(jié)論

本研究以釀酒酵母為出發(fā)菌株，以NaN3（10 μmol/L、處理40 min）為誘變劑、H2O2（2.50%）為選擇壓力，成功篩選出2株可高水平將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的富硒酵母菌株HXS-01和HXS-02。富硒特性分析表明，菌株HXS-01和HXS-02的總硒和有機(jī)硒含量分別比出發(fā)菌株高3.4～3.7倍和3.7～4.0倍，均在2 100 μg/g以上，48 h搖瓶富硒培養(yǎng)的總硒和有機(jī)硒產(chǎn)率分別比出發(fā)菌株高2.9～3.2倍和3.1～3.5倍，均在7 000 μg/L以上，有機(jī)硒占總硒的百分比均超過(guò)97%，經(jīng)連續(xù)6次傳代后它們?nèi)员３址€(wěn)定的富硒和轉(zhuǎn)化有機(jī)硒的能力，且它們的硒磷酸合成酶活性和蛋白硒含量均顯著高于出發(fā)菌株，菌株HXS-02的富硒能力優(yōu)于菌株HXS-01。結(jié)果表明，耐H2O2的誘變菌株不僅具有高的富硒及轉(zhuǎn)化無(wú)機(jī)硒為有機(jī)硒的能力，而且具有高的SPS活性，提示它們的高富硒能力與高SPS活性相關(guān)，鑒于SPS是硒蛋白合成的關(guān)鍵酶且H2O2可抑制其活性，可以說(shuō)明耐H2O2的菌株具有高的SPS活性，而高SPS活性的菌株具有高水平富集、轉(zhuǎn)化無(wú)機(jī)硒為有機(jī)硒的能力。利用H2O2作為一種新的選擇壓力可以有效篩選出具有高SPS活性的富硒酵母菌株，并可用于生產(chǎn)實(shí)際。