肖澤濤，李 嘯， *，張小龍，葉 晗，談亞麗，裴宇鵬

（1.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院 中國(guó)輕工業(yè)酵母功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002；2.湖北省酵母功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）是一種能夠利用乳糖進(jìn)行生長(zhǎng)的酵母，因此該酵母一般能夠從乳源中分離出來(lái)[1-2]。馬克斯克魯維酵母不僅生長(zhǎng)迅速、耐熱性高、底物譜廣以及能產(chǎn)生多種酶[3-6]，而且具有通常被認(rèn)為是安全的（generally recognized as safe，GRAS）的認(rèn)證地位[1]。2013年該酵母被中國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)批準(zhǔn)為新食品原料[7-8]。由于馬克斯克魯維酵母具有以上這些特性，并且該酵母在某些營(yíng)養(yǎng)特性方面與釀酒酵母類似[9]，因此有望代替釀酒酵母利用廉價(jià)廢棄物進(jìn)行食品工業(yè)的生產(chǎn)。這就有必要對(duì)其生長(zhǎng)特性進(jìn)行深入研究。

Crabtree效應(yīng)是指即使是在有氧條件下，較高的糖濃度也會(huì)使酵母細(xì)胞由呼吸型向發(fā)酵型（產(chǎn)乙醇）轉(zhuǎn)變，也就是高速同化葡萄糖而引起的好氧呼吸阻遏作用[10]。Crabtree效應(yīng)不利于酵母細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸，會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且乙醇對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)有較大的抑制作用[11]。值得注意的是，雖然馬克斯克魯維酵母被歸類為Crabtree陰性菌株[12-13]。但是有報(bào)道指出該酵母確實(shí)攜帶有通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇所必需的基因[1]，且具有良好的乙醇發(fā)酵能力[8，14]。王亮等[15]通過(guò)試驗(yàn)表明，當(dāng)培養(yǎng)基中糖質(zhì)量濃度＞65 g/L時(shí)，馬克斯克魯維酵母的生長(zhǎng)就會(huì)受到抑制，因此推測(cè)酵母可能受到Crabtree效應(yīng)的影響。如此看來(lái)，文獻(xiàn)中關(guān)于馬克斯克魯維酵母的Crabtree效應(yīng)的報(bào)道不一致。因此有必要針對(duì)該情況對(duì)酵母的生理學(xué)特性進(jìn)行研究。

本研究采用搖瓶分批培養(yǎng)和發(fā)酵罐分批培養(yǎng)從6株馬克斯克魯維酵母中篩選出一株生長(zhǎng)能力較好的菌株。并進(jìn)一步研究該菌株的生長(zhǎng)和生理特性。在此基礎(chǔ)上選擇合適的補(bǔ)料策略對(duì)酵母進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的大量積累，對(duì)馬克斯克魯維酵母的產(chǎn)業(yè)化具有一定指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）A#、B#、C#、D#、E#、F#：由安琪酵母菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose medium，YEPD）培養(yǎng)基[16]：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨1%。115 ℃滅菌20 min。

分批發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖6%，酵母浸粉1.2%，（NH4）2SO40.2%，KH2PO40.3%，MgSO40.03%。pH5.5，115℃滅菌20min。

1.2 儀器與設(shè)備

FUS-50 L型新概念發(fā)酵罐：上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備有限公司；PAS7000型生物尾氣分析儀：重慶哈特曼科技有限公司；ZHWY-211D腳踏開(kāi)門型大容量全溫度恒溫?fù)u床：上海智城生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及種子液制備

將保藏于甘油管的馬克斯克魯維酵母菌株接入裝液量為20 mL/250 mL YEPD培養(yǎng)基中進(jìn)行初次復(fù)壯，30 ℃、160 r/min條件下[15]培養(yǎng)20 h。再將初次復(fù)壯后的菌液接入分批發(fā)酵培養(yǎng)基作種子液。接種量10%，30 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)10 h。若是種子液用量較大，如用于發(fā)酵罐上的研究，則按相同的培養(yǎng)條件進(jìn)行適當(dāng)擴(kuò)培。

1.3.2 搖瓶篩選試驗(yàn)

按10%的接種量分別將6株馬克斯克魯維酵母的種子液接入裝液量為45 mL/250 mL分批發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶分批培養(yǎng)，在30 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)18 h[15]。培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定細(xì)胞干質(zhì)量（g/L），以細(xì)胞干質(zhì)量為指標(biāo)篩選出生長(zhǎng)能力較好的菌株用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 在3 L發(fā)酵罐中的分批培養(yǎng)

將酵母種子液按10%接種量接入裝有1.8 L分批發(fā)酵培養(yǎng)基的3 L發(fā)酵罐中進(jìn)行分批培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度30 ℃，空氣流量6 L/h，攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min。從0 h開(kāi)始，每隔1 h取樣，離線測(cè)定細(xì)胞干質(zhì)量X、比生長(zhǎng)速率μ、發(fā)酵液糖濃度和pH，直至細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)穩(wěn)定期。將各指標(biāo)進(jìn)行整理分析，以研究菌株在3 L發(fā)酵罐中的分批培養(yǎng)過(guò)程。其中比生長(zhǎng)速率μ的計(jì)算公式如下：

式中：μ為細(xì)胞比生長(zhǎng)速率，h-1；X為細(xì)胞干質(zhì)量，g/L；t為培養(yǎng)

時(shí)間，h；為兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞干質(zhì)量的平均值，g/L。

1.3.4 在50 L發(fā)酵罐中的分批培養(yǎng)

將酵母種子液按10%接種量接入裝有18 L分批發(fā)酵培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐中進(jìn)行分批培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速350 r/min[21]，空氣流量50 L/min，罐壓0.045 MPa。從0 h開(kāi)始，每隔1 h取樣，離線測(cè)定細(xì)胞干質(zhì)量、比生長(zhǎng)速率、殘?zhí)?、酒精含量，并利用發(fā)酵罐配備的pH電極、溶氧電極和尾氣分析儀在線監(jiān)測(cè)發(fā)酵液pH、溶氧水平、二氧化碳釋放速率（carbon-dioxide escape rate，CER）、氧氣攝取速率（oxygen uptake rate，OUR）和呼吸商（respiratory quotient，RQ），直至細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)穩(wěn)定期。將各指標(biāo)進(jìn)行整理分析，以研究菌株在50 L發(fā)酵罐的分批培養(yǎng)過(guò)程。

1.3.5 馬克斯克魯維酵母的補(bǔ)料分批培養(yǎng)

將酵母種子液按10%接種量接入裝有18 L無(wú)菌蒸餾水（培養(yǎng)底水）的50 L發(fā)酵罐中進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)。結(jié)合分批培養(yǎng)研究結(jié)果，采用合適的補(bǔ)料策略，流加糖蜜（27.5%）、氨水（16.5%）和磷酸二氫銨（10%）。培養(yǎng)溫度30 ℃，初始發(fā)酵液pH值為5.0，初始攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，空氣流量恒定為50 L/min，罐壓恒定為0.045 MPa。當(dāng)發(fā)酵液體積達(dá)發(fā)酵罐的工作體積時(shí)結(jié)束發(fā)酵。對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心，對(duì)菌體進(jìn)行洗滌并收集。測(cè)定菌體細(xì)胞的蛋白質(zhì)、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）、海藻糖、灰分和各氨基酸等組分含量。

1.3.6 分析檢測(cè)

細(xì)胞干質(zhì)量測(cè)定采用質(zhì)量法[16]。酒精含量的測(cè)定采用馬丁儀滴定法[17]。采用生物傳感器測(cè)定發(fā)酵液中糖濃度。CER、OUR和RQ等由Biostar 1.5在線分析控制系統(tǒng)計(jì)算。相關(guān)細(xì)胞組分的測(cè)定委托安琪酵母檢測(cè)中心。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬克斯克魯維酵母的搖瓶分批培養(yǎng)結(jié)果

六株馬克斯克魯維酵母在相同培養(yǎng)條件下的搖瓶生長(zhǎng)情況，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 6株馬克斯克魯維酵母菌株在搖瓶中的分批培養(yǎng)情況Fig.1 Situation of batch culture of 6 strains of Kluyveromyces marxianus in shake flask

由圖1可知，F(xiàn)#菌株的細(xì)胞干質(zhì)量最高，可達(dá)（11.21±0.18）g/L。其次是B#菌株，其細(xì)胞干質(zhì)量為（11.08±0.38）g/L。而A#和C#菌株的細(xì)胞干質(zhì)量較低，分別為（9.75±0.18）g/L和（9.51±0.58）g/L。結(jié)果表明，菌株B#和F#生長(zhǎng)情況較好，因此后續(xù)試驗(yàn)是采用3 L發(fā)酵罐對(duì)這兩株菌株進(jìn)行分批培養(yǎng)，研究其培養(yǎng)過(guò)程，比較兩株菌的生長(zhǎng)情況。

2.2 兩株馬克斯克魯維酵母在3 L發(fā)酵罐中的分批培養(yǎng)過(guò)程對(duì)比

按1.3.3節(jié)方法對(duì)馬克斯克魯維酵母B#菌株和F#菌株進(jìn)行分批培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程各指標(biāo)變化結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 菌株B#與F#在3 L發(fā)酵罐上的分批培養(yǎng)過(guò)程曲線Fig.2 Batch culture process curve of strains B#and F#in 3 L fermenter

由圖2可知，在分批培養(yǎng)過(guò)程中，B#菌株的比生長(zhǎng)速率（μ）在2 h時(shí)達(dá)到最大，為1.15±0.01，而F#菌株的比生長(zhǎng)速率（μ）是在3 h時(shí)達(dá)到最大，為0.69±0.04。但是在隨后的培養(yǎng)中，由于B#菌株細(xì)胞積累較慢，其μ值急劇下降，而F#菌株細(xì)胞積累較快，其μ值呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。B#菌株的耗糖速度比F#菌株快，當(dāng)糖濃度處于較低水平時(shí)，發(fā)酵液pH開(kāi)始回彈。菌株F#最終的細(xì)胞干質(zhì)量為（12.96±0.03）g/L，高于菌株B#（11.93±0.04）g/L。因此，菌株F#相比菌株B#在生長(zhǎng)方面更具優(yōu)勢(shì)，采用菌株F#進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 馬克斯克魯維酵母在分批培養(yǎng)過(guò)程中的生長(zhǎng)特性研究

采用帶有尾氣分析儀的50 L發(fā)酵罐按1.3.4節(jié)方法對(duì)馬克斯克魯維酵母F#菌株進(jìn)行分批培養(yǎng)，其培養(yǎng)過(guò)程各指標(biāo)的變化見(jiàn)圖3。

由圖3A可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞比生長(zhǎng)速率逐漸上升，并在培養(yǎng)時(shí)間3 h之后達(dá)最大值，為0.62±0.17。細(xì)胞進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，開(kāi)始迅速生長(zhǎng)。發(fā)酵液中糖濃度，pH和溶氧水平快速降低。由圖3B可知，此時(shí)CER與OUR數(shù)值均較高，表明細(xì)胞呼吸強(qiáng)度較高。當(dāng)發(fā)酵液中糖耗完時(shí)、pH微微回彈，溶氧水平迅速回升，CER與OUR快速下降，細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入靜止期，細(xì)胞干質(zhì)量最終達(dá)（20.9±0.18）g/L。在葡萄糖沒(méi)有被耗完的時(shí)間里（0～5 h），CER高于OUR，RQ高于1.26，因此該時(shí)期內(nèi)細(xì)胞不是進(jìn)行完全的有氧呼吸，無(wú)氧呼吸強(qiáng)度較高。這導(dǎo)致酒精含量上升，并在5 h后升至較高水平（1.976±0.02）%。因此，馬克斯克魯維酵母F#菌株可能存在Crabtree效應(yīng)：即較高的糖濃度可能誘發(fā)酵母細(xì)胞產(chǎn)生酒精，而這種發(fā)酵模式不利于細(xì)胞的積累。

圖3 菌株F#在50 L發(fā)酵罐中的分批培養(yǎng)過(guò)程曲線Fig.3 Batch culture process curve of strain F#in 50 L fermenter

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該菌株是否存在Crabtree效應(yīng)，后續(xù)試驗(yàn)將選擇合適的補(bǔ)料策略對(duì)F#菌株進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)，使發(fā)酵液中糖濃度既能滿足細(xì)胞生長(zhǎng)需求，又不至于過(guò)高。在這種補(bǔ)料策略下研究細(xì)胞生長(zhǎng)與酒精產(chǎn)生的趨勢(shì)。

目前，有一種常用的補(bǔ)料技術(shù)就是根據(jù)乙醇的變化控制糖的進(jìn)料速率，從而避免酵母細(xì)胞的Crabtree效應(yīng)[10，16，18]。然而如果只采用乙醇含量這一離線參數(shù)作為主要的控制信號(hào)則可能導(dǎo)致補(bǔ)料速率調(diào)節(jié)的延遲效應(yīng)，那么就會(huì)很容易錯(cuò)過(guò)最佳調(diào)控機(jī)會(huì)[19]。因此還需綜合分析線上參數(shù)（RQ、溶氧和pH等），制定更合適的補(bǔ)料策略，才能有效避免這種延遲效應(yīng)。

2.4 針對(duì)馬克斯克魯維酵母Crabtree效應(yīng)的補(bǔ)料分批培養(yǎng)

采用1.3.5節(jié)方法，對(duì)F#菌株進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)。具體的補(bǔ)料策略如下：①通過(guò)監(jiān)測(cè)RQ的變化控制糖的補(bǔ)料速率。在培養(yǎng)前期，當(dāng)RQ＜1.00時(shí)，表明發(fā)酵液中糖濃度無(wú)法滿足酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)。此時(shí)上調(diào)糖的補(bǔ)料速率。而RQ＞1.15時(shí)，表明酵母細(xì)胞無(wú)氧呼吸強(qiáng)度較高，這是由發(fā)酵液中糖濃度較高引起的，因此適當(dāng)下調(diào)糖的補(bǔ)料速率，使RQ逐漸降至1.00～1.15。另外根據(jù)2.3節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果：培養(yǎng)前期為酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的延滯期，此時(shí)酵母對(duì)氧氣的需求不大，溶氧水平較高，因此在補(bǔ)料分批培養(yǎng)試驗(yàn)中，將初始轉(zhuǎn)速下調(diào)為200 r/min。到了培養(yǎng)中期，由于酵母細(xì)胞生長(zhǎng)較快，耗糖速率開(kāi)始增加，溶氧水平也會(huì)迅速降低，因此逐漸上調(diào)糖的補(bǔ)料速率同時(shí)上調(diào)轉(zhuǎn)速以滿足酵母生長(zhǎng)需要，但仍然以RQ在1.00～1.15為準(zhǔn)；②在酵母的培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)酵液pH會(huì)降低，故通過(guò)調(diào)節(jié)氨水的補(bǔ)料速率將pH維持在適合酵母生長(zhǎng)的范圍里（4.5～5.5），同時(shí)氨水還能作為被酵母利用的氮源；③培養(yǎng)過(guò)程中持續(xù)補(bǔ)充磷酸二氫銨以滿足酵母對(duì)磷源和氮源的需求。有相關(guān)報(bào)道表明馬克斯克魯維酵母能利用糖蜜進(jìn)行生長(zhǎng)[20]，故本研究采用安琪酵母股份有限公司的糖蜜作為流加碳源，以期對(duì)馬克斯克魯維酵母的產(chǎn)業(yè)化提供指導(dǎo)。上述所流加的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（糖蜜、氨水與磷酸二氫銨）及其濃度的確定是基于前期相關(guān)的工作。培養(yǎng)過(guò)程各指標(biāo)變化分別見(jiàn)圖4和圖5。

圖4 菌株F#在補(bǔ)料分批培養(yǎng)過(guò)程中的發(fā)酵在線指標(biāo)Fig.4 Fermentation online indicators of strain F#in the fed batch culture process

由圖4A和圖4B可知，通過(guò)這種補(bǔ)料策略，使得RQ盡可能在1.00～1.15。RQ在這個(gè)范圍內(nèi)表明酵母細(xì)胞有氧呼吸強(qiáng)度較高，補(bǔ)充的碳氮源剛好可以滿足酵母生長(zhǎng)需求，同時(shí)又保證發(fā)酵液中沒(méi)有過(guò)多的糖來(lái)誘發(fā)酵母細(xì)胞產(chǎn)酒精。因此發(fā)酵液中的糖濃度和酒精含量一直處于低水平（糖質(zhì)量濃度最高不超過(guò)4.5 g/L，而酒精含量也一直處在0.2%vol以內(nèi)）。再結(jié)合上2.3節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果：糖濃度較高時(shí)，發(fā)酵液中的酒精含量上升。這表明馬克斯克魯維酵母菌株F#存在Crabtree效應(yīng)，并且這一補(bǔ)料策略能有效地減弱酵母細(xì)胞的Crabtree效應(yīng)，同時(shí)補(bǔ)充的營(yíng)養(yǎng)源能夠滿足細(xì)胞生長(zhǎng)需求，細(xì)胞干質(zhì)量一直在上升（見(jiàn)圖5）。

圖5 菌株F#的補(bǔ)料分批培養(yǎng)過(guò)程曲線Fig.5 Fed batch culture process curve of strain F#

到了培養(yǎng)中期，隨著細(xì)胞生長(zhǎng)，溶氧水平顯著降低。5 h以后，發(fā)酵液中的溶氧水平較低（見(jiàn)圖4B），此時(shí)酵母細(xì)胞的呼吸反應(yīng)速率和生長(zhǎng)速率均會(huì)受限，因此細(xì)胞比生長(zhǎng)速率逐漸下降（見(jiàn)圖5）。培養(yǎng)到12 h，發(fā)酵液體積達(dá)發(fā)酵罐的工作體積（33 L），結(jié)束培養(yǎng)，最終細(xì)胞干質(zhì)量達(dá)（54.37±3.3）g/L。

培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定菌體的相關(guān)組分，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，細(xì)胞中灰分、蛋白質(zhì)、RNA和海藻糖等含量分別為8.16%、47.41%、7.12%、1.21%，細(xì)胞中天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、賴氨酸含量較高，而半胱氨酸和組氨酸含量較低。

表1 菌株F#在補(bǔ)料分批培養(yǎng)后的細(xì)胞組分Table 1 Composition of cell after fed batch culture by strain F#

由以上結(jié)果可以看出，通過(guò)監(jiān)測(cè)RQ的變化控制糖的補(bǔ)料速率以及補(bǔ)充氮源氨水調(diào)節(jié)pH，不僅可以使酵母細(xì)胞大量積累，并且還能有效減弱菌株F#的Crabtree效應(yīng)。另外與菌株F#的分批培養(yǎng)結(jié)果（見(jiàn)2.3節(jié)）相比，采用這種補(bǔ)料策略培養(yǎng)菌株F#12 h，細(xì)胞干質(zhì)量提高了160.29%。因此，對(duì)于這株菌的高細(xì)胞密度培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，這種補(bǔ)料策略具有一定的優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)馬克斯克魯維酵母進(jìn)行中間試驗(yàn)，研究培養(yǎng)過(guò)程中該酵母的生長(zhǎng)情況及相關(guān)呼吸參數(shù)和代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，以實(shí)現(xiàn)酵母細(xì)胞的大量積累。通過(guò)搖瓶和3 L發(fā)酵罐的分批培養(yǎng)從6株馬克斯克魯維酵母中確定了F#菌株在生長(zhǎng)方面更具優(yōu)勢(shì)，培養(yǎng)后細(xì)胞干質(zhì)量達(dá)（11.21±0.18）g/L。采用50 L發(fā)酵罐對(duì)菌株F#進(jìn)行分批培養(yǎng)，進(jìn)一步研究培養(yǎng)過(guò)程中酵母細(xì)胞的生理代謝變化情況。采用合適的補(bǔ)料策略對(duì)F#菌株進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)。通過(guò)線上監(jiān)測(cè)RQ，pH和溶氧的變化來(lái)調(diào)控糖蜜，氨水的補(bǔ)料速率以及轉(zhuǎn)速。不僅滿足了酵母的生長(zhǎng)需要，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞大量積累，同時(shí)使得發(fā)酵液中糖濃度較低，因此酒精含量也低于0.2%。這進(jìn)一步證明了菌株F#的Crabtree效應(yīng)。最終培養(yǎng)12 h，細(xì)胞干質(zhì)量達(dá)（54.37±3.3）g/L，與菌株F#的分批培養(yǎng)結(jié)果相比，細(xì)胞干質(zhì)量提高了160.29%。以廉價(jià)營(yíng)養(yǎng)源實(shí)現(xiàn)了馬克斯克魯維酵母細(xì)胞的大量積累。本研究針對(duì)馬克斯克魯維酵母的Crabtree效應(yīng)提供了合適的補(bǔ)料策略，對(duì)該菌株的工業(yè)生產(chǎn)具有一定指導(dǎo)意義。