蕭崗，楊建輝，魯葆春，余建華，方劍鋒，傅宏，陳志良

（紹興市人民醫(yī)院/浙江大學(xué)紹興醫(yī)院 肝膽胰外科，浙江 紹興 312000）

膽囊癌惡性程度高、預(yù)后差，確診時大多數(shù)病例處于晚期，早期發(fā)現(xiàn)、手術(shù)治療是膽囊癌的有效治療手段。而目前判斷膽囊癌術(shù)前局部進(jìn)展和淋巴轉(zhuǎn)移情況，既缺乏有效的腫瘤標(biāo)記物，影像學(xué)難以提供充分的依據(jù)。近年來有研究表明，在膽囊癌的發(fā)生和進(jìn)展過程中存在著不同程度的凝血功能異常，其中血漿纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)g）水平與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分期密切相關(guān)，術(shù)前Fg正常的膽囊癌患者預(yù)后明顯好于伴高纖維蛋白原血癥者的膽囊癌患者[1-2]。文獻(xiàn)表明，F(xiàn)gβ鏈的合成是整個Fg分子合成的限速步驟，其中β鏈基因啟動子區(qū)-455位點存在G/A多態(tài)性，目前認(rèn)為β鏈-455位點G/A多態(tài)性與血漿Fg水平相關(guān)[3-4]。因此，我們進(jìn)行血漿Fgβ-455G/A基因多態(tài)性與膽囊癌之間的相關(guān)性研究，為提高膽囊癌早期診斷率以及準(zhǔn)確判斷術(shù)前膽囊癌局部進(jìn)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況提供新的檢測指標(biāo)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

資料來自2016年1月至2019年3月紹興市人民醫(yī)院收住的膽囊癌患者及同期膽囊結(jié)石伴膽囊炎患者。

膽囊癌組患者50例，納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床資料和組織病理學(xué)確診為膽囊癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）轉(zhuǎn)移性膽囊癌；（2）合并有其他惡性腫瘤；（3）合并凝血異常的疾病，近期服用過任何影響凝血功能的藥物。其中男17例，女33例；年齡47～90歲，平均（68.36±7.73）歲，其中≤60歲9例，＞60歲41例。組織學(xué)分型腺癌48例，腺鱗癌1例，神經(jīng)內(nèi)分泌癌1例；TNM分期I～I(xiàn)I 18例，III～I(xiàn)V 32例（采血時未行化療，以2017 AJCC膽囊癌TNM分期第八版作為診斷和分期的參照標(biāo)準(zhǔn)）。膽囊炎組50例，均來自膽囊結(jié)石伴慢性膽囊炎手術(shù)病例，其中男20例，女30例，年齡46～84歲，平均（65.85±6.97）歲，其中≤60歲12例，＞60歲38例。兩組患者的性別、年齡等一般情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集和DNA提?。盒录{入研究患者術(shù)前清晨空腹抽取外周靜脈血2 mL，置于抗凝管中。運用全基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），按說明書從上述1 mL外周血中提取出基因組DNA，溶解于0.1×TE的緩沖液中（10 mmol/l Tris-1 mmol/L EDTA，pH 8.0），保存于-20 ℃待測。

1.2.2 Fgβ-455G/A基因分型：SNP分型是由上海Sangon生物工程公司應(yīng)用美國Sequenom公司的MassARRAY系統(tǒng)完成，該系統(tǒng)是基于基質(zhì)輔助激光解析時間飛行質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF）。PCR引物和單基因延伸引物都是由上海Sangon生物工程公司合成。Fgβ-455G/A上游引物：5’-ATAGAATAGGGTATG AATITG-3’，下游引物：5’-GGCTGAACCATTTTATC ATTT-3’。通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增，堿性磷酸酶處理，延伸反應(yīng)，產(chǎn)物純化，芯片點樣，質(zhì)譜檢測等實驗步驟，最后使用Typer 4.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)，得到基因分型結(jié)果。實驗步驟詳見文獻(xiàn)[5]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。應(yīng)用Hardy-Weinberg平衡檢驗方法計算膽囊癌患者基因型的分布并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗，如P＞0.05則樣本的人群基因頻率符合遺傳平衡法則，具有恒定性。我們用χ2檢驗來分析膽囊癌患者基因型和等位基因頻率的分布；膽囊癌組各基因型或等位基因頻率間的關(guān)系采用非條件Logistic回歸分析，計算優(yōu)勢比（odds ratio，OR）及其95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）。

2 結(jié)果

2.1 Fgβ-455基因多態(tài)性Hardy-Weinberg平衡檢驗

膽囊癌與膽囊炎組人群基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（膽囊炎組χ2=0.422，P＞0.05；膽囊癌組χ2=0.168，P＞0.05），見表1。

2.2 膽囊癌組與膽囊炎組中Fgβ-455基因型分布和等位基因頻率的比較

膽囊癌組Fgβ-455基因GG、GA、AA與膽囊炎組進(jìn)行比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.345，P=0.025）；Fgβ-455的G、A等位基因頻率膽囊癌組與膽囊炎組進(jìn)行比較，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.228，P=0.004）。見表2。

表1 Fgβ-455基因多肽性Hardy-Weinberg平衡檢驗

表2 各組中Fgβ-455G/A基因多態(tài)性的分布和等位基因頻率的比較

2.3 Fgβ-455G/A中不同基因型對膽囊癌的相對危險度

進(jìn)行單變量二元Logisitc回歸探討Fgβ-455G/A基因多態(tài)性與膽囊癌之間的關(guān)系，結(jié)果提示，相對于GG基因型而言，GA雜合型與GA+AA都會顯著增加膽囊癌的危險性，OR值（95%CI）分別為2.526（1.052～6.068）和2.901（1.288～6.534），P值分別為0.036和0.009。突變純合子AA型的OR值（95%CI）為4.306（1.177～15.749），P=0.021。見表3。

表3 Fgβ-455G/A中不同基因型對膽囊癌的相對危險度

3 討論

膽囊癌早期癥狀不典型，缺乏敏感的檢測指標(biāo)，確診時多數(shù)病例已處于晚期，往往無法手術(shù)根治。因此，臨床上亟需敏感的檢測指標(biāo)來輔助膽囊癌的早期診斷。血漿纖維蛋白原（Fg）是一種由肝臟合成的具有凝血功能的蛋白質(zhì)，是血漿中含量最高的凝血因子，是反映機體凝血功能的重要指標(biāo)。近年來流行病學(xué)研究表明，血漿Fg水平變化不僅與凝血機制變化有關(guān)，而且與心血管疾病、血栓、糖尿病、惡性腫瘤等有關(guān)，尤其是在惡性腫瘤的監(jiān)測與預(yù)后判斷上有著極其重要的意義[6-7]。目前的研究大多集中在對于Fgβ的基因多態(tài)性分析上，其中Fgβ-455G/A是發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的。但這方面的研究在膽囊癌領(lǐng)域較少。因此本研究探討血漿Fgβ-455G/A基因多態(tài)性與膽囊癌之間的相關(guān)性，目的是輔助膽囊癌的早期診斷及治療。

楊芳等[8]研究結(jié)果顯示，F(xiàn)gβ-455G/A基因多態(tài)性和大腸癌的發(fā)生具有一定的相關(guān)性，相對于GG型而言，GA雜合型顯著增加大腸癌發(fā)生發(fā)展的危險性，而突變純合子AA型降低了大腸癌發(fā)生發(fā)展的危險性，因此認(rèn)研究者為在大腸癌的發(fā)病中Fgβ-455G/A位點G/A單個堿基的更改可能起著重要作用。本研究中，膽囊癌組及膽囊炎組Fgβ-455G/A基因型符合Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，說明樣本具有一定的群體代表性。研究結(jié)果顯示，膽囊癌組Fgβ-455G基因GG、GA、AA頻率分別為18（36%）、22（44%）、10（20%）；膽囊炎組分別為31（62%）、15（30%）、4（8%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。本研究通過單變量Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，相較于GG型而言，GA雜合型和AA純合子型顯著增加了膽囊癌發(fā)生的危險性，OR值（95%CI）分別為2.526（1.052～6.068）和4.306（1.177～15.749），成為膽囊癌發(fā)生的獨立危險因素。筆者分析原因，可能是Fgβ-455位點G突變?yōu)锳，導(dǎo)致Fg分子結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了異常，使機體進(jìn)入癌變、侵襲、轉(zhuǎn)移的“快車道”。

但Fg在膽囊癌發(fā)生、發(fā)展中具體起了什么作用，具體機制如何，仍有待于進(jìn)一步的研究。同時，本研究還存在樣本量不足等局限，由于AA型的Fgβ-455在人群中構(gòu)成比例偏低，因此研究結(jié)論尚需更大規(guī)模的人群驗證。各基因型與Fg血漿濃度有無相關(guān)性，也有待研究。