王菲，姚臻，許佳，石宇紅

（1.廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院 兒科，廣西 桂林 541002；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，廣西 桂林 541001）

毛細(xì)支氣管炎是嬰幼兒常見的感染性呼吸道疾病，可反復(fù)發(fā)病，往往表現(xiàn)為喘憋、咳嗽等癥狀[1]。國外研究顯示，毛細(xì)支氣管炎患兒肺部嗜酸性粒細(xì)胞聚集并伴有血清免疫球蛋白E（IgE）水平升高，其發(fā)病具有類似哮喘的發(fā)病機(jī)制[2-3]。既往研究[2]發(fā)現(xiàn)，毛細(xì)支氣管炎患兒病程中血清IL-4、IL-8 水平明顯升高，且存在外周血T 淋巴細(xì)胞比值異常的現(xiàn)象，提示IL-4、IL-8和外周血T 淋巴細(xì)胞在毛細(xì)支氣管炎病程進(jìn)展中發(fā)揮作用。故本研究通過觀察不同月齡、不同疾病嚴(yán)重程度的嬰幼兒急性毛細(xì)支氣管炎中血清IL-4、IL-8 和外周血T 淋巴細(xì)胞亞群比例的變化，試圖評(píng)估毛細(xì)支氣管炎患兒不同月齡及不同疾病嚴(yán)重程度對(duì)血清IL-4、IL-8 和外周血T 淋巴細(xì)胞亞群變化的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年3月—2018年6月在廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院兒科住院的急性毛細(xì)支氣管炎患兒 142例。診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組《毛細(xì)支氣管炎診斷、治療與預(yù)防專家共識(shí)（2014年版）》[4]， 將患兒按疾病程度分為輕度組（53例）、中度組（35例）和重度組（54例）。每組再按月齡分為≤6 個(gè)月亞組和＞6 個(gè)月亞組。另選取同期37例為對(duì)照組，其中，健康體檢嬰幼兒11例，排除感染的住院術(shù)前準(zhǔn)備嬰幼兒26例（隱睪癥5例，腹股溝疝10例，皮膚血管瘤8例，先天性唇裂3例），鼻咽分泌物和血清檢測(cè)呼吸道合胞病毒均為陰性。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＜24 個(gè)月；②首次患毛細(xì)支氣管炎；③經(jīng)病原學(xué)檢測(cè)（血清間接免疫熒光法或鼻咽拭子免疫熒光法）確診為呼吸道合胞病毒感染。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有風(fēng)濕性疾病、過敏性疾病或惡性腫瘤者；②入院前1 周口服、靜脈或外用糖皮質(zhì)激素、白三烯受體拮抗劑、免疫調(diào)節(jié)劑、抗生素、抗病毒藥者；③早產(chǎn)、先天性呼吸道畸形或心臟病、合并其他病原體感染等；④患兒監(jiān)護(hù)人拒絕參與本研究者。研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有納入研究的患兒其監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集與檢測(cè)方法患兒入院后治療前空腹采集外周靜脈血2 管各2 ml（EDTA 抗凝和無抗凝血），抗凝血離心后獲血清，置于-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)錂z。IL-4 和IL-8 血清濃度采用酶聯(lián)免疫比色法檢測(cè)，按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行。2 h 內(nèi)無抗凝血用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血T 淋巴細(xì)胞亞群，操作按實(shí)驗(yàn)說明書進(jìn)行；該實(shí)驗(yàn)操作在桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科進(jìn)行。

1.3.2 主要儀器與試劑IL-4、IL-8 的酶聯(lián)免疫試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司，Thermo scientific Multiskan FC 自動(dòng)酶標(biāo)分析儀購自美國Thermo scientific 公司，流式細(xì)胞分析用溶血素和淋巴細(xì)胞亞群 檢測(cè)試劑（流式細(xì)胞儀法-6 色）購自美國Becton Dickinson 公司，流式細(xì)胞儀（BD FACS Canto Ⅱ型）購自 美國Becton Dickinson 公司，呼吸道合胞病毒抗原檢測(cè)使用7 項(xiàng)呼吸道病毒抗原檢測(cè)試劑盒（免疫熒光法）購自美國Diagnostic Hybrids 公司。

1.3.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)降鈣素原（PCT）；免疫比濁法檢測(cè)超敏C 反應(yīng)蛋白（hs-CRP）；酶聯(lián)免疫分析比色法檢測(cè)血清IL-4、IL-8； 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+T 淋巴細(xì)胞比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組性別、月齡、PCT 及hs-CRP 水平的比較

各組PCT、hs-CRP 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），輕、中、重度組患兒PCT、hs-CRP 水平高于對(duì)照組（P＜0.05）。輕、中、重度組PCT 和hs-CRP 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 各亞組血清IL-4 和IL-8 水平的比較

≤6 個(gè)月亞組或＞6 個(gè)月亞組不同疾病程度組IL-4 和IL-8 水平與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩個(gè)亞組中以重度組的IL-4、IL-8 水平最高（P＜0.05），以對(duì)照組的IL-4 和IL-8 水平最低，但對(duì)照組與輕度組比較無差異（P＞0.05）。見表2、3。

表1 各組性別、月齡、PCT 和hs-CRP 水平的比較

表2 ≤6 個(gè)月亞組不同疾病程度患兒血清IL-4 和 IL-8 水平的比較 （pg/ml，±s）

表2 ≤6 個(gè)月亞組不同疾病程度患兒血清IL-4 和 IL-8 水平的比較 （pg/ml，±s）

注：?與重度組比較，P ＜0.05。

組別 n IL-4 IL-8輕度組 28 34.88±7.32? 63.23±7.51?中度組 17 59.75±10.72? 95.32±9.45?重度組 27 79.45±11.17 117.64±14.41對(duì)照組 17 32.36±9.76? 58.43±10.08?F 值 144.096 108.778 P 值 0.000 0.000

表3 ＞6 個(gè)月亞組不同疾病程度的患兒血清IL-4、IL-8 水平的比較 （pg/ml，±s）

表3 ＞6 個(gè)月亞組不同疾病程度的患兒血清IL-4、IL-8 水平的比較 （pg/ml，±s）

注：?與重度組比較，P ＜0.05。

組別 n IL-4 IL-8輕度組 25 34.08±8.51? 61.30±8.83?中度組 18 48.75±9.13? 88.79±9.66?重度組 27 69.20±10.25 125.94±13.90對(duì)照組 20 32.41±11.09? 58.68±10.22?F 值 187.734 128.954 P 值 0.000 0.000

2.3 各亞組外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD3+ CD56+T 淋巴細(xì)胞比值的比較

≤6 個(gè)月亞組和＞6 個(gè)月亞組不同疾病嚴(yán)重程度患兒的外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+T 淋巴細(xì)胞比值與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。中、重度組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。重度組CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞比值高于其他組（P＜0.05），≤6 個(gè)月亞組和＞6 個(gè)月亞組最高；重度組CD3+CD8+和CD3+CD56+T 淋巴細(xì)胞比值低于其他組（P＜0.05），≤6 個(gè)月亞組和＞6 個(gè)月亞組最低。見表4、5。

2.4 不同疾病程度組血清IL-4、IL-8 水平和外周血 CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+T 淋巴細(xì)胞比值 的比較

中度組患兒：≤6 個(gè)月亞組與＞6 個(gè)月亞組血清 IL-4 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.862，P= 0.001）?！? 個(gè)月亞組與＞6 個(gè)月亞組其余各指標(biāo)比較， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。重度組患兒：≤6 個(gè)月 亞組與＞6 個(gè)月亞組血清IL-4、IL-8 水平和外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+T 淋巴細(xì)胞比值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.163、-2.246、2.069、-2.518和-2.687，P=0.004、0.033、0.049、0.018 和0.012）。輕度組患兒：≤6個(gè)月亞組與＞6個(gè)月亞組各指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 ≤6 個(gè)月亞組患兒外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+和 CD3+CD56+T 淋巴細(xì)胞比值的比較 （%，±s）

表4 ≤6 個(gè)月亞組患兒外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+和 CD3+CD56+T 淋巴細(xì)胞比值的比較 （%，±s）

注：①與重度組比較，P ＜0.05；②與對(duì)照組比較，P ＜0.05。

組別 n CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD3+CD56+輕度組 28 36.02±11.62① 22.83±7.62① 13.76±10.08①中度組 17 42.82±8.82①② 19.92±10.03①② 9.82±8.35①②重度組 27 45.55±11.42② 11.10±13.62② 5.89±8.64②對(duì)照組 17 38.77±12.53① 22.01±12.31① 14.12±9.56①F 值 12.331 22.051 26.913 P 值 0.001 0.000 0.000

表5 ＞6 個(gè)月亞組患兒外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD3+CD56+T 淋巴細(xì)胞比值的比較 （%，±s）

表5 ＞6 個(gè)月亞組患兒外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD3+CD56+T 淋巴細(xì)胞比值的比較 （%，±s）

注：①與重度組比較，P ＜0.05；②與對(duì)照組比較，P ＜0.05。

組別 n CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD3+CD56+輕度組 25 37.71±10.53① 23.07±9.85① 14.24±7.58①中度組 18 40.48±10.33①② 19.86±12.41①② 11.67±7.88①②重度組 27 43.14±10.15② 14.22±9.65② 7.02±7.44②對(duì)照組 20 38.18±10.08① 22.75±10.80① 13.69±8.25①F 值 14.331 34.051 29.913 P 值 0.000 0.000 0.000

3 討論

毛細(xì)支氣管炎是嬰幼兒常見的急性呼吸道感染疾病。因小月齡的嬰兒免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不成熟，故重癥毛細(xì)支氣管炎在6 個(gè)月內(nèi)的嬰兒中多見。感染病原體多為病毒，呼吸道合胞病毒為主要的病原體[5-6]。除病原體對(duì)支氣管的直接入侵所致外，還與炎癥因子釋放后導(dǎo)致毛細(xì)支氣管炎痙攣有關(guān)。大量研究顯示，毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病機(jī)制中有很多炎癥細(xì)胞和炎癥因子參與[7-8]。T 淋巴細(xì)胞可分為輔助性T 細(xì)胞（helper T cell, Th）、抑制性T 細(xì)胞（supressor T cell, Ts）和細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（cytotoxic T cell, Tc）。Th 膜表面表達(dá)CD4+分子,可促進(jìn)體液和細(xì)胞免疫；Ts和Tc膜表面表達(dá)CD8+分子，起抑制Th 細(xì)胞免疫反應(yīng)的作用。呼吸道合胞病毒感染常出現(xiàn)T 細(xì)胞免疫失衡[7-8]。Th1 細(xì)胞分泌的代表因子之一是γ-干擾素（Interferon-γ, IFN-γ），而Th2 細(xì)胞分泌的代表因子之一是IL-4 和IL-8。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，呼吸道合胞病毒感染后的毛細(xì)支氣管炎患兒血清IL-4升高，IFN-γ 下降明顯，IL-4 相對(duì)IFN-γ 處于優(yōu)勢(shì)水平，提示Th1 細(xì)胞活動(dòng)受抑制，Th2 細(xì)胞活躍。IL-4可激活B 細(xì)胞,并激發(fā)肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)、增加合成IgE 而引起喘息。IL-8 由肺內(nèi)的巨噬細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生，可趨化嗜中性粒細(xì)胞從血管內(nèi)遷移、向肺間質(zhì)和肺泡中聚集，能增加嗜中性粒細(xì)胞活性、脫顆粒并放大炎癥,造成組織損傷[9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，肺部感染患兒的痰液、支氣管肺泡灌洗液中IL-8 顯著增加[10]。因此，可以認(rèn)為患兒感染呼吸道合胞病毒后體內(nèi)T 淋巴細(xì)胞明顯紊亂，尤其是Th1/Th2 失調(diào)可能是造成毛細(xì)支氣管炎病理生理過程的重要機(jī)制。但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，毛細(xì)支氣管炎患兒治療前后均無IL-4 等炎癥因子水平差異[11]。因此，本研究測(cè)定毛細(xì)支氣管炎患兒血清IL-4、IL-8 及外周血T 淋巴細(xì)胞比值情況，研究毛細(xì)支氣管炎患兒的細(xì)胞免疫紊亂情況。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，呼吸道合胞病毒感染后，所有患兒血清IL-4、IL-8 水平均高于對(duì)照組，與很多研究的結(jié)論是一致的[12-14]，且疾病嚴(yán)重程度越高，IL-4 水平越高；月齡越小，IL-4 水平越高。本研究不同月齡組不同疾病嚴(yán)重程度的毛細(xì)支氣管炎患兒血清IL-4、IL-8 檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，≤6月亞組重度組的患兒的IL-4、IL-8 水平最高，與其他組比較有差異。提示月齡越小的患兒，被呼吸道合胞病毒感染后越容易出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致更嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)。這可能與月齡小的患兒免疫功能發(fā)育尚不完善有關(guān)[15]。

自然殺傷細(xì)胞可分泌IFN-γ[16-17]。IFN-γ 可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-4 等因子，放大炎癥[18]；同時(shí)也能促使外周血CD8+T 淋巴細(xì)胞分化成Tc，聚集到感染局部，清除病毒并抑制炎癥。有研究顯示，毛細(xì)支氣管炎的患兒體內(nèi)細(xì)胞免疫功能顯著失調(diào)，尤其是病情更重、月齡更小患兒的T 淋巴細(xì)胞明顯異常[15-16]。劉亞娜等[19]發(fā)現(xiàn)，毛細(xì)支氣管炎患兒外周血中自然殺傷細(xì)胞較健康對(duì)照組降低。LIU 等[20]發(fā)現(xiàn)，被呼吸道合胞病毒感染后的鼠毛細(xì)支氣管炎模型，肺泡內(nèi)自然殺傷細(xì)胞明顯增加。吳小磊等[21]在肺炎患兒肺泡灌洗液和血清中均發(fā)現(xiàn)外周血CD8+T 淋巴細(xì)胞降低。據(jù)此推測(cè)，可能是炎癥因子募集自然殺傷細(xì)胞、外周血CD8+T 淋巴細(xì)胞進(jìn)入肺內(nèi)，引起外周血的自然殺傷細(xì)胞、外周血CD8+T 細(xì)胞降低。本研究結(jié)果顯示，≤6 個(gè)月亞組中度、重度組患兒的外周血CD3+CD4+T 淋巴細(xì)胞比值高于＞6 個(gè)月亞組；外周血CD3+CD8+、CD3+CD56+T 淋巴細(xì)胞比值低于＞6 個(gè)月亞組。兩個(gè)亞組重度組的外周血CD3+CD56+T 淋巴細(xì)胞比值最低，外周血CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞比值最高。隨著疾病嚴(yán)重程度增加、月齡越小的患兒外周血CD3+CD8+和CD3+CD56+T 淋巴細(xì)胞比值越低。這與現(xiàn)有的一些研究呈現(xiàn)某些類似的特點(diǎn)[15]。但本研究也顯示和既往一些研究結(jié)論的不同之處：兩個(gè)亞組輕度組外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD3+CD56+T 淋巴細(xì)胞比值比較均無差異；＞6 個(gè)月亞組輕度組和中度組外周血CD3+/CD56+T 淋巴細(xì)胞比值無差異。這可能與呼吸道合胞病毒感染后炎癥程度較輕、或?yàn)楦腥驹缙?，尚未全面激發(fā)T 細(xì)胞功能失調(diào)有關(guān)，也可能與本研究未同時(shí)分析患兒入院前病程長(zhǎng)短有關(guān)，故尚需更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來驗(yàn)證。

本研究對(duì)患兒進(jìn)行血清IL-4、IL-8 水平檢測(cè)，并檢測(cè)T 淋巴細(xì)胞亞群，證實(shí)在呼吸道合胞病毒感染的毛細(xì)支氣管炎中，有多種炎癥細(xì)胞和炎癥因子參與氣道炎癥，且炎癥反應(yīng)的程度和患兒月齡、病情嚴(yán)重程度有關(guān)。本研究也有不足之處：①未對(duì)入組的患兒按病程長(zhǎng)短分組，如能結(jié)合病程長(zhǎng)短進(jìn)行分析，可能對(duì)血清IL-4、IL-8 和外周血T 細(xì)胞亞群的結(jié)果有影響；②僅僅采集患兒入院時(shí)的血樣進(jìn)行分析，未進(jìn)行治療后的復(fù)查，不能全面評(píng)估血清IL-4、IL-8 和外周血T 淋巴細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化情況。

綜上所述，呼吸道合胞病毒感染后毛細(xì)支氣管炎存在炎癥細(xì)胞和炎癥因子紊亂狀態(tài)，且和疾病嚴(yán)重程度、月齡有關(guān)；如果對(duì)毛細(xì)支氣管炎患兒從病原學(xué)特點(diǎn)、免疫功能方面調(diào)整治療方案，則可能會(huì)有助于干預(yù)病程進(jìn)展。