房子倩，龔永媚，徐昊，黃健華，黃克強(qiáng)

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 正畸科，遼寧 錦州 121004；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 外科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121000）

舌癌是口腔癌中常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)，舌癌發(fā)病率居口腔癌第1 位[1]。舌癌生長(zhǎng)快、浸潤(rùn)性強(qiáng)、惡性程度較高，常波及舌肌致舌運(yùn)動(dòng)受限以及語(yǔ)言障礙、吞咽困難，并易通過(guò)血液、淋巴循環(huán)通路至全身轉(zhuǎn)移，預(yù)后差[2]。目前手術(shù)為主的綜合治療是其主要治療方式，由于位置較為特殊，手術(shù)切除范圍受限，且易破壞患者容貌，給患者身心帶來(lái)極大傷害。近年來(lái)舌癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)且不斷年輕化[3]，因此，研究新型有效藥物對(duì)于舌癌的治療有重要意義。

熊果酸是一種存在于天然植物中的三萜類(lèi)化合物，廣泛存在于蔬菜和中藥中。已證明熊果酸具有抗炎、降溫、保護(hù)肝損傷等作用[4-5]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸有抗癌及抗血管生成等作用[6-8]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于熊果酸對(duì)舌癌影響及機(jī)制的詳細(xì)研究相對(duì)較少，本實(shí)驗(yàn)以人舌癌細(xì)胞Tca8113 為研究對(duì)象，探究熊果酸對(duì)其生長(zhǎng)、遷移和凋亡的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熊果酸（藥物濃度≥98%，南京景竹生物公司）， 分子式：C30H48O3，分子量為456.68，CAS 號(hào)：77-52-1。 人舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113（美國(guó)ATCC 公司），胎牛血清、RPMI1640 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司），MTT（Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide）試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（武漢碧云天生物公司），兔抗人局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase, Fak）、磷酸化局部黏著斑激酶（phosphorylated focal adhesion kinase, p-Fak）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（B cell Lymphoma 2, Bcl-2）、Bcl-2- Associated X 的 蛋 白 質(zhì)（Bcl-2-associated X protein,Bax）、活化冬氨酸蛋白水解酶-3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3, Cleaved-caspase 3）抗體、 辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 抗體（沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物公司），流式細(xì)胞儀、電泳儀（美國(guó)BD 公司），自動(dòng) 凝膠成像儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司），倒置顯微鏡（德國(guó)LEICA 公司）。

1.2 方法

將含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基（含青霉素100 u/ml、鏈霉素100 mg/L）置于37℃、5%二氧化碳恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)人舌癌Tca8113 細(xì)胞。待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用0.25% EDTA 胰蛋白酶消化和傳代，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 MTT 法測(cè)試熊果酸對(duì)Tca8113 細(xì)胞活性的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Tca8113 細(xì)胞消化后離心收集，重懸后稀釋濃度為5×104個(gè)/ml 接種于96 孔板中，每孔加200 恒溫箱培養(yǎng)24 h 后，加入不同濃度梯度（0、20、40、50、80 及100 μmol/L）熊果酸的培養(yǎng)基于預(yù)設(shè)6 組復(fù)孔中，24 h 后每孔中加20 μl MTT 染色液孵育4 h，吸出上清液后加150 μl DMSO，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)490 nm）測(cè)各孔光密度（OD）值，計(jì)算各濃度細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。計(jì)算方法：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組A 值/對(duì)照組A 值）× 100%。

1.2.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Tca8113 細(xì)胞消化后離心收集，重懸接種于6 孔板內(nèi)，500 個(gè)/孔。待細(xì)胞貼壁后加入80 μmol//L 含熊果酸培養(yǎng)液并設(shè)置陰性對(duì)照組。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d 后吸棄培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌2 次后加結(jié)晶紫染色10 min，PBS 再次清洗，拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)熊果酸對(duì)舌癌細(xì)胞Tca8113 遷移的影響將密度為4×105個(gè)/ml 的Tca8113 細(xì)胞每孔2 ml 接種于6 孔板中，置恒溫箱培養(yǎng)24 h，細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)90%左右時(shí)用200 μl 移液器槍頭均勻劃痕，用PBS 洗滌去除漂浮細(xì)胞，加入含熊果酸（8 μmol/L） 培養(yǎng)液并設(shè)空白對(duì)照組。分別于0、12 及24 h 后觀(guān)察對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組劃痕遷移情況，用Image J 圖像處理軟件分別測(cè)量0、12 及24 h 的劃痕間距并計(jì)算其遷移率。

1.2.4 Hoechst33342 染色觀(guān)察舌癌細(xì)胞Tca8113 的凋亡Tca8113 細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，消化收集后制成細(xì)胞懸液接種于12 孔板內(nèi)，每孔1×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞融合90%左右，加藥分別培養(yǎng)0、12 及24 h 后，加入5 μg/ml Hoechst33342 工作液于37℃恒溫孵箱染色15 min，用熒光照相顯微鏡拍照記錄。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Tca8113 細(xì)胞的凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Tca8113 細(xì)胞消化后離心收集，按5×105個(gè)細(xì)胞接種于4 個(gè)培養(yǎng)皿中，設(shè)置空白對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組（熊果酸80 μmol/L），孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后觀(guān)察。加藥培養(yǎng)后分別于12 和24 h 消化離心，PBS 清洗2 次后加入150 μl PBS 重懸細(xì)胞。向細(xì)胞懸液內(nèi)加入5 μl AV（annexin V-FITC），4℃避光下孵育15 min 后加入10 μl 碘化丙錠（PI），混勻后孵育5 min，上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 Western blotting 檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Tca8113 細(xì)胞消化重懸后制成密度為5× 105個(gè)/ml 的單細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中，待融合至80%時(shí)進(jìn)行加藥實(shí)驗(yàn)。設(shè)置空白對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組；收集Tca8113 細(xì)胞并于0、1、3、6、12 及24 h 后分別取出相應(yīng)培養(yǎng)皿，待細(xì)胞在冰上裂解后提取細(xì)胞蛋白并檢測(cè)蛋白濃度后制樣。上樣后進(jìn)行電泳，用聚偏二氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜，封閉1.5 h 后，分別加一抗p-Fak、Fak、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3，4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗，經(jīng)室溫孵育2 h 后洗滌，加高敏熒光顯影液曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 軟件，計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熊果酸對(duì)Tca8113 細(xì)胞活性的影響

MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用不同濃度（0、20、40、 50、80 及100 μmol/L）熊果酸處理Tca8113 細(xì)胞，細(xì)胞 增殖抑制率分別為（0.00±0.00）%、（7.41±0.56）%、（22.19±1.64）%、（41.58±1.10）%、（51.11±2.00）%和（71.08±2.71）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.595，P=0.000），隨藥物濃度增加，細(xì)胞增殖抑制率上升（見(jiàn)圖1）。熊果酸濃度設(shè)為0 μmol/L 組、40 μmol/L 組和80 μmol/L 組，其克隆形成率分別為（73.0±3.6）%、（13.6±2.8）%和（0.0±0.0）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義（F=36.442，P=0.000）；與0 μmol/L 組比較，40 μmol/L 組和80 μmol/L 組克隆形成率降低（P＜ 0.05），80 μmol/L 組未見(jiàn)明顯克隆株，處于靜止期（見(jiàn)圖2）。

圖1 不同濃度熊果酸處理24 h 對(duì)Tca8113 細(xì)胞活性的影響（±s）

圖2 不同濃度熊果酸對(duì)細(xì)胞克隆形成的影響（±s）

2.2 熊果酸對(duì)人舌癌Tca8113 細(xì)胞凋亡的影響

0 h 組細(xì)胞細(xì)胞核彌散均勻藍(lán)光，顏色較為淺淡，形態(tài)規(guī)則，無(wú)固縮、碎裂；12 h 組出現(xiàn)多數(shù)細(xì)胞核高亮度熒光染色，不同程度固縮、碎裂；24 h 組大部分細(xì)胞細(xì)胞核呈高亮熒光染色，核固縮、碎裂的細(xì)胞更多（見(jiàn)圖3）。

給 藥0、12 和24 h 后凋 亡率分別 為（0.73± 0.12）%、（21.91±1.30）% 和（44.36±2.04）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=736.006，P= 0.000）；與0 h 組比較，12 h 和24 h 組凋亡率升高（P＜ 0.05），且隨時(shí)間的增加凋亡率隨之升高（見(jiàn)圖4）。

2.3 熊果酸對(duì)舌癌細(xì)胞Tca8113 遷移的影響

12 和24 h 后空白對(duì)照組發(fā)生遷移（見(jiàn)圖5、6 和表1），實(shí)驗(yàn)組的劃痕比空白對(duì)照組寬，遷移率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，鏡下觀(guān)察可見(jiàn)細(xì)胞的體積減小、形態(tài)皺縮等變化，劃痕后細(xì)胞愈合能力降低并隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。12 h 實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.911，P=0.041）；24 h 實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.539，P=0.001）；24 h 實(shí)驗(yàn)組與12 h 實(shí)驗(yàn)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= -13.735，P=0.000）。

2.4 Tca8113 細(xì)胞的相關(guān)蛋白表達(dá)

各相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平在不同時(shí)間點(diǎn)的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），p-Fak、Fak、Bcl-2 的蛋白 表達(dá)水平隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低，而B(niǎo)ax、Cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)水平隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高。見(jiàn)圖7 和表2。

圖3 各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變（Hoechst33342 染色）

圖4 熊果酸對(duì)Tca8113 細(xì)胞凋亡的影響

圖5 兩組不同時(shí)間點(diǎn)的劃痕比較

圖6 熊果酸對(duì)Tca8113 細(xì)胞遷移能力的影響（±s）

表1 熊果酸對(duì)Tca8113 細(xì)胞遷移率的影響 （n =3，%，±s）

表1 熊果酸對(duì)Tca8113 細(xì)胞遷移率的影響 （n =3，%，±s）

注：①與空白對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與12 h 實(shí)驗(yàn)組比較，P ＜ 0.05。

組別 12 h 24 h空白對(duì)照組 14.29±3.50 64.23±6.70實(shí)驗(yàn)組 7.14±2.60① 47.83±5.10①②

圖7 熊果酸對(duì)Tca8113 細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

表2 各時(shí)間點(diǎn)不同蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 （±s）

表2 各時(shí)間點(diǎn)不同蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 （±s）

組別 Bcl-2 Bax Cleaved Caspase-3 p-Fak Fak 0 h 1.302±0.045 0.242±0.013 0.131±0.003 0.738±0.039 0.775±0.064 1 h 1.063±0.059 0.323±0.009 0.209±0.009 0.583±0.019 0.709±0.044 3 h 0.836±0.036 0.468±0.010 0.292±0.008 0.528±0.020 0.623±0.026 6 h 0.724±0.031 0.552±0.020 0.357±0.012 0.508±0.020 0.571±0.027 12 h 0.615±0.041 0.747±0.038 0.462±0.019 0.273±0.016 0.186±0.009 24 h 0.576±0.033 0.931±0.049 0.529±0.032 0.163±0.008 0.113±0.008 F 值 131.910 255.415 236.973 259.171 180.578 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討論

熊果酸又名烏蘇酸，以與糖結(jié)合成苷或者游離的形式分布于多種植物中，有抗菌、降血糖等多種生物活性[9]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)熊果酸有抗腫瘤作用，通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞活性、凋亡、血管生成、遷移等多種生物學(xué)功能進(jìn)行調(diào)控[10]，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展的作用[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)舌癌Tca8113 細(xì)胞有抑制作用且呈濃度依賴(lài)性，提示熊果酸有抗腫瘤作用，與相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果[12-15]一致。在前列腺癌研究中，熊果酸通過(guò)ROCK/PTEN 介導(dǎo)Cofilin-1 線(xiàn)粒體定位，從而誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的凋亡[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熊果酸對(duì)Tca8113 細(xì)胞具有促凋亡作用，且呈時(shí)間依賴(lài)性。細(xì)胞凋亡是由基因主導(dǎo)的細(xì)胞自發(fā)有序死亡過(guò)程，大致分為內(nèi)源性途徑和外源性途徑2 種，其中內(nèi)源性凋亡的核心環(huán)節(jié)是線(xiàn)粒體途徑，其過(guò)程包括抗凋亡因子Bcl-2 表達(dá)量減少，促凋亡因子Bax 的表達(dá)量增加并轉(zhuǎn)位線(xiàn)粒體，進(jìn)一步調(diào)節(jié)Cyt C，使Cyt C 釋放入胞漿，激活Caspase-9 進(jìn)而召集激活Caspase-3，引起Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，下游底物剪切被激活從而發(fā)生細(xì)胞凋亡[17]，其中Bcl-2 和Bax 的比值對(duì)內(nèi)源性凋亡有重大影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Tca8113 細(xì)胞經(jīng)熊果酸作用后Bax 表達(dá)量增強(qiáng)，而B(niǎo)cl-2 表達(dá)量減弱，Bcl-2/Bax 比值降低，且Cleaved caspase-3 表達(dá)增強(qiáng)，提示熊果酸可誘導(dǎo)Tca8113 細(xì)胞的凋亡?？赏茰y(cè)熊果酸能促進(jìn)Bax 等促凋亡基因表達(dá)而抑制Bcl-2 等抑凋亡基因表達(dá)，進(jìn)而激活Caspase-3 引發(fā)其級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。GAYATHRI 等[18]發(fā)現(xiàn)熊果酸能通過(guò)線(xiàn)粒體凋亡的途徑誘導(dǎo)白血病細(xì)胞K562 凋亡，與本研究結(jié)果相符。

腫瘤細(xì)胞的遷移與細(xì)胞外基質(zhì)黏附作用有關(guān)， Fak 是一種蛋白酪氨酸激酶，可調(diào)節(jié)各種類(lèi)型細(xì)胞的黏附、運(yùn)動(dòng)、遷移和存活。Fak 在晚期癌癥中可通過(guò)與整合素、G 蛋白偶聯(lián)受體和細(xì)胞因子受體的相互作用而被激活，并促進(jìn)癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[19]。在膠質(zhì)瘤研究中發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制Fak 表達(dá)，可抑制其遷移能力[20]。研究表明[21]，抑制乳腺癌細(xì)胞的Fak 后，其細(xì)胞遷移減少，降低了乳腺癌發(fā)生，并認(rèn)為Fak 是通過(guò)維持腫瘤干細(xì)胞的量來(lái)促進(jìn)癌癥的發(fā)生。Fak 激酶依賴(lài)性功能通常與局灶性黏連的整合素相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)，在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中的細(xì)胞遷移和黏附中起重要作用，其結(jié)構(gòu)位于Fak 的中間并含有活化環(huán)，酪氨酸（Y）位點(diǎn)Y576 和Y577，它們可被Src 磷酸化，可以抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[22]?；罨腇ak 作為腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵信號(hào)介質(zhì)起著重要作用，表明Fak 是癌癥治療的潛在靶點(diǎn)[23]。本研究劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一定濃度熊果酸可對(duì)Tca8113 遷移起到抑制作用，同時(shí)經(jīng)熊果酸處理后p-Fak、Fak 表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明熊果酸可抑制Tca8113 細(xì)胞的遷移，這一結(jié)論與其在其他腫瘤中的現(xiàn)象一致[24-25]。

綜上所述，熊果酸作為一種天然植物中的三萜類(lèi)化合物，能抑制舌癌Tca8113 細(xì)胞的體外活性，下調(diào)p-Fak、Fak 抑制其遷移，并通過(guò)促進(jìn)Bax 表達(dá)、抑制Bcl-2 表達(dá)，誘導(dǎo)其凋亡。