賈麗艷 暢盼盼 張 麗 蘇芳翠 郝 林 馬淑英

（1山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山西太谷030801）

（2山西省白酒生物工程研究所教育創(chuàng)新中心，山西太谷 030801）

（3蒙牛乳業(yè)太原有限公司，山西太原 030000）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） 廣泛存在于自然界中，不產(chǎn)毒素和熱致敏蛋白，被歸為食品級微生物范疇?？莶菅挎邨U菌A32（簡稱菌株A32）是從山西老陳醋醋醅中篩選出的一株能產(chǎn)廣譜抑菌素的菌株。菌株A32 可以產(chǎn)抑菌物質H2O2 和細菌素，其發(fā)酵液經(jīng)過氧化氫酶處理后的抑菌能力反映了菌株A32 產(chǎn)細菌素的能力。由于菌株A32 來源明確、食用安全，具有開發(fā)成益生菌微生態(tài)制劑并應用于食品領域的潛能。

通過選擇來源廣泛、價格低廉的食品級碳源和氮源，開發(fā)一種安全且高產(chǎn)細菌素的食品級培養(yǎng)基，對進一步提高菌株A32 及其所產(chǎn)細菌素在食品中的應用，降低其生產(chǎn)成本，具有重要意義。本研究以食品級原料為發(fā)酵底物，通過單因素試驗篩選出最適的碳源、氮源，確定最佳的料液比、發(fā)酵時間、發(fā)酵初始pH、搖床轉速；利用PB 試驗篩選出關鍵的影響因子；采用響應面法對篩選出的關鍵因子進行優(yōu)化，從而獲得高產(chǎn)細菌素A32 的最佳發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株A32，分離自山西老陳醋醋醅，山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程生物工程實驗室保藏。

指示菌，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程生物工程學院保藏。

1.2 試劑

過氧化氫酶（5 000 U/mg），北京索寶來科技有限公司；蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、氯化鈉、胰蛋白胨等為常規(guī)試劑。

高粱粉、土豆粉、小米、綠豆粉、豌豆、黑豆等，均購自山西太谷縣家家利超市。

1.3 主要儀器及設備

YS04A 小型高速粉碎機，北京燕山正德機械有限公司；GZX-GF101-3-BS-Ⅱ/H 電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；ZWY-1102C恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智誠分析儀器制造有限公司；DHP-500S 型電熱培養(yǎng)箱，北京市光明醫(yī)療儀器廠；牛津杯，上海兢翀電子科技發(fā)展有限公司；Thermo Scientific 移液器，賽默飛世爾（上海） 儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸膏0.5 g、胰蛋白胨1.0 g、NaCl 1.0 g、蒸餾水100 mL，pH 7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏0.5 g、蛋白胨1.0 g、NaCl 0.5 g、瓊脂粉2.0 g,蒸餾水100 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.4.2 菌株A32 的活化和培養(yǎng)

將菌株A32 接種于牛肉膏培養(yǎng)基中活化，30℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h。按照4%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min 的條件下振蕩培養(yǎng)36 h。

1.4.3 菌株A32 發(fā)酵液及其所產(chǎn)細菌素的抑菌性試驗

將過氧化氫酶溶解于枯草芽孢桿菌上發(fā)酵清液中，使過氧化氫酶終濃度達到5 μg/mL，30 ℃，溫浴2 h。取200 μL 過氧化氫酶處理前后的發(fā)酵液做牛津杯抑菌試驗，測定其抑菌圈直徑大小。每組做3 個平行。

1.4.4 培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.4.4.1 碳源的篩選

分別稱取15 g 高粱粉、小米粉、土豆粉代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源酵母膏，加水1 000 mL，胰蛋白胨和氯化鈉添加量保持不變，以發(fā)酵培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基組作為對照組，將菌株A32 以4%接種量接入培養(yǎng)基中，30 ℃、130 r/min 培養(yǎng)36 h，5 000 r/m離心15 min～20 min，做菌株A32 發(fā)酵液及其所產(chǎn)細菌素的抑菌性試驗，確定最佳碳源。每組做3 個平行。

1.4.4.2 氮源的篩選

在發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，以篩選出的最佳碳源為基礎，分別稱取10 g 綠豆粉、豌豆粉和黑豆粉代替胰蛋白胨作為氮源，加水1 000 mL，氯化鈉的添加量保持不變，以不加氮源組為空白對照。將菌株A32 以4%的接種量接入培養(yǎng)基中，30 ℃，130 r/min 培養(yǎng)36 h，做菌株A32 發(fā)酵液的抑菌試驗，確定最佳氮源。每組做3 個平行。

1.4.4.3 料液比的篩選

在發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，選用試驗篩選出的最佳碳氮源取代酵母膏和胰蛋白胨，保持水添加量不變，逐倍增加碳源和氮源的添加量，使其料液比分別為：1∶40，1∶20，3∶40，1∶10，1∶8，制備成培養(yǎng)基。將菌株A32 以4%接種量接入培養(yǎng)基中，30 ℃，130 r/min 培養(yǎng)36 h，做菌株A32 發(fā)酵液的抑菌試驗，確定最佳料液比。每組做3 個平行。

1.4.4.4 起始pH 值的篩選

以最佳料液比為基礎，設置起始pH 分別為4、5、6、7、8，制備成培養(yǎng)基。將菌株A32 以4%接種量接入培養(yǎng)基中，30 ℃，130 r/min 培養(yǎng)36 h，做菌株A32 發(fā)酵液的抑菌試驗，確定最佳起始pH值。每組做3 個平行。

1.4.4.5 發(fā)酵時間的確定

以篩選出的最佳起始pH 值和最佳料液比為基礎，制備成無菌培養(yǎng)基。將菌株A32 以4%接種量接入培養(yǎng)基中，30 ℃，130 r/min 分別培養(yǎng)24 h、48 h、36 h、60 h、72 h，做菌株A32 發(fā)酵液的抑菌試驗，確定最佳發(fā)酵時間。每組做3 個平行。

1.4.4.6 搖床轉速的確定

以篩選出的最佳起始pH 值、最佳料液比、最佳發(fā)酵時間為基礎，在0 r/min、130 r/min、140 r/min、150 r/min、160 r/min、170 r/min 的轉速下，30 ℃培養(yǎng)36 h，做菌株A32 發(fā)酵液的抑菌試驗，確定最佳搖床轉速。每組做3 個平行。

1.4.5 PB 試驗設計

依據(jù)碳氮源及發(fā)酵條件的篩選結果，菌株A32的發(fā)酵培養(yǎng)基影響因素包括高粱粉添加量、綠豆粉添加量、料液比、培養(yǎng)基起始pH 值、發(fā)酵時間及搖床轉速，對以上幾個因素進行PB 試驗設計見表1。

表1 因子篩選試驗因素水平表

1.4.6 Box-Behnken 響應面試驗設計

根據(jù)PB 試驗結果，篩選出對S.aureus 抑菌活性顯著的影響因素，結合因素的效應大小和試驗中的實際情況，以抑菌圈直徑大小為響應值設計三因素三水平的響應面試驗（表2），得出其最佳的培養(yǎng)及發(fā)酵條件。

表2 響應面優(yōu)化因素水平表

2 結果與分析

2.1 碳源對菌株A32 產(chǎn)細菌素的影響

以食品級碳源代替發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源培養(yǎng)菌株A32 并檢測其發(fā)酵液的抑菌性，結果如圖1 所示。由圖1 可知，以高粱粉為碳源的菌株A32 發(fā)酵液對S.aureus 的抑菌圈直徑為（27.0±0.63） mm，過氧化氫酶處理后的菌株A32 發(fā)酵液的抑菌圈直徑為（22.3±0.29） mm，表明以高粱粉為碳源的菌株A32 產(chǎn)細菌素的能力最強。造成以上現(xiàn)象的原因可能是：①與菌株A32 的來源有關。菌株A32 分離自以高粱為主要原料的新鮮醋醅，菌株在長期馴化過程中對高粱適應性更強、利用率更高。②與高粱粉營養(yǎng)成分比較豐富有關。高粱除含淀粉65.9%～77.4%，蛋白質8.4%～14.5%，粗脂2.4%～10.4%外，還含有豐富的氨基酸、維生素及礦物元素等營養(yǎng)物質，能夠滿足菌株所需的營養(yǎng)需求。此外，由于高粱粉來源廣泛，成本低廉，因此選擇高粱粉作為菌株A32 的碳源。

2.2 氮源對菌株A32 產(chǎn)細菌素的影響

圖1 碳源對菌株A32 產(chǎn)細菌素能力的影響

氮源是菌體生長必不可少的原料，對菌體的生長和代謝具有重要意義。氮源對菌株A32 產(chǎn)細菌素的影響結果見圖2。由圖2 可知，添加氮源后發(fā)酵液的抑菌效果均明顯高于未添加氮源組，且綠豆粉作為氮源，其發(fā)酵液的抑菌效果強于其他對照組。以綠豆粉為氮源的菌株A32 發(fā)酵液對S.aureus 的抑菌圈直徑為（21.3±0.29） mm；過氧化氫酶處理后的菌株A32 發(fā)酵液抑菌圈直徑為（16.4±0.85） mm，表明當?shù)礊榫G豆粉時，菌株A32 產(chǎn)細菌素的能力最強。此外，綠豆粉來源廣泛、價格低廉，因此選擇綠豆粉作為菌株A32 食品級培養(yǎng)基的氮源。

圖2 氮源對菌株A32 產(chǎn)細菌素能力的影響

2.3 料液比對菌株A32 產(chǎn)細菌素的影響

料液比對菌株A32 產(chǎn)細菌素的影響結果見圖3。由圖3 可知，隨著料液比的增大，營養(yǎng)物質濃度增加，菌體的營養(yǎng)條件豐富，生長代謝旺盛，產(chǎn)抑菌物質的能力增強。當料液比為3:40 時，發(fā)酵液的抑菌效果達到最優(yōu)。未經(jīng)過氧化氫酶處理的菌株A32 發(fā)酵液對S.aureus 的抑菌圈直徑為（25.6±1.15） mm，過氧化氫酶處理后，菌株A32 發(fā)酵液對S.aureus 的抑菌圈直徑為（22.0±0.30） mm，表明當料液比為3:40 時，菌株A32 產(chǎn)細菌素的能力最強。

圖3 料液比對菌株A32 產(chǎn)細菌素能力的影響

2.4 起始pH 值對菌株A32 產(chǎn)細菌素的影響

pH 是影響微生物繁殖及代謝的重要外界因子，同時調節(jié)發(fā)酵過程中各種代謝產(chǎn)物及酶活，不同的pH 值通過影響菌體的代謝過程，改變產(chǎn)物的產(chǎn)量及質量，試驗結果見圖4。由圖4 可知，當起始pH值為6.0 時，菌株A32 發(fā)酵液對S.aureus 的抑菌圈直徑達到最大。未經(jīng)過氧化氫酶處理的發(fā)酵液對S.aureus 的抑菌圈為（25.8±0.66） mm，處理后的抑菌圈為（23.2±0.53） mm，結果表明起始pH 值為6.0 時，菌株A32 產(chǎn)細菌素的能力最強。

圖4 起始pH 對菌株A32 產(chǎn)細菌素能力的影響

2.5 發(fā)酵時間對菌株A32 產(chǎn)細菌素的影響

發(fā)酵時間對菌株A32 產(chǎn)細菌素能力的影響結果見圖5。由圖5 可知，當發(fā)酵時間達到60 h 時，發(fā)酵液對S.aureus 的抑菌效果均達到最大。過氧化氫酶處理前菌株A32 發(fā)酵液對S.aureus 的抑菌圈直徑為（29.2±2.21） mm；過氧化氫酶處理后，菌株A32 發(fā)酵液對S.aureus 的抑菌圈直徑為（25.4±0.65） mm，表明發(fā)酵時間為60 h 時，菌株A32 產(chǎn)細菌素的能力最強。

圖5 發(fā)酵時間對菌株A32 產(chǎn)細菌素能力的影響

2.6 搖床轉速對菌株A32 產(chǎn)細菌素的影響

菌株A32 屬于好氧型微生物，其繁殖代謝需要氧氣的參與。在發(fā)酵液和水中氧氣的溶解度較小，需要通過不斷的通風和攪拌，使氧氣充分進入發(fā)酵液中，促進微生物的代謝及繁殖。溶氧的多少也會影響菌體生長和代謝產(chǎn)物含量及質量。同時，充足的氧氣雖然有利于菌體的生長和產(chǎn)物合成，但當氧氣含量過高時反而會抑制產(chǎn)物的形成。本試驗通過調整搖床轉速來控制發(fā)酵液溶氧量，試驗結果見圖6。

圖6 搖床轉速對菌株A32 產(chǎn)細菌素能力的影響

由圖6 可知，當搖床轉速達到140 r/min 時，菌株A32 發(fā)酵液對S.aureus 的抑制圈直徑達到最大。過氧化氫酶處理前，菌株A32 發(fā)酵液對S.aureus 的抑菌圈直徑為（24.0±0.63） mm；過氧化氫酶處理后，菌株A32 發(fā)酵液的抑菌圈直徑為（18.3±0.33） mm，表明當搖床轉速為140 r/min 時，菌株A32 產(chǎn)細菌素能力最強。

綜合單因素試驗，發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶處理前后，菌株A32 的發(fā)酵液的抑菌圈大小的變化趨勢一致，表明菌株A32 發(fā)酵液的抑菌能力跟菌株A32 產(chǎn)細菌素能力具有一致性。為此，在后期產(chǎn)細菌素發(fā)酵條件的優(yōu)化過程中，用菌株A32 發(fā)酵液抑菌圈的大小來反映菌株A32 所產(chǎn)細菌素能力。

2.7 PB 試驗結果

設計12 組PB 試驗，對培養(yǎng)基組分：高粱粉添加量（A）、綠豆粉添加量（B），發(fā)酵條件：料液比（C）、發(fā)酵時間（D）、搖床轉速（E） 及培養(yǎng)基起始pH 值（F） 共6 個因素進行研究，根據(jù)前期試驗確定各因素水平，響應值為未經(jīng)過氧化氫酶處理的菌株A32 發(fā)酵液對S.aureus 的抑菌性大小，試驗設計及結果見表3。

表3 Plackets-Burman 試驗設計與結果

利用Minitab17 軟件對其結果進行方差分析（表4）?；貧w方程為菌株A32 發(fā)酵液抑菌圈直徑X=15.879+1.001A+1.206B -0.204C+1.124D -0.166E+0.359F，對模型進行匯總，判定系數(shù)R2=0.922 5，該模型的擬合度較好，且模型P=0.012，表明該篩選模型顯著。根據(jù)表中顯著性分析可知，高粱粉添加量（P=0.011）、綠豆粉添加量（P=0.005）、發(fā)酵時間（P=0.007） 三者P 值均小于0.05，在α=0.05 的概率水平上差異顯著。因此，選擇高粱粉添加量、綠豆粉添加量、發(fā)酵時間3 個因素進行響應面試驗。

表4 Plackets-Burman 試驗方差分析

2.8 響應面試驗結果

在PB 試驗結果分析的基礎上，用Design-Expert 軟件進行響應面優(yōu)化試驗設計。設計因素組合表及結果見表5。

表5 試驗設計方案及結果

應用Design-Expert 軟件對所得的試驗結果進行回歸分析，獲得菌株A32 發(fā)酵液的抑菌圈直徑對高粱粉添加量、綠豆粉添加量、發(fā)酵時間的二次多項式回歸方程式分別如下：

菌株A32 發(fā)酵液的抑菌圈直徑X=25.68+1.15A-0.15B-0.12C+1.05AB-0.70AC+0.65BC-1.82A2-2.07B2-4.06C2；

表6 響應面優(yōu)化二階回歸模型方差分析

根據(jù)表6 方差分析結果確定，建立模型的失擬項均不顯著，R2為0.905 7，說明該模型的擬合性比較高、誤差小，可以采用此模型（回歸方程） 代替試驗真實點對響應值進行相關預測和分析。同時，由回歸方程回歸系數(shù)顯著性檢驗可知，二次項系數(shù)A2、B2、C2的值均小于0.05，說明多個試驗因子對響應值的影響具有顯著作用；而高粱粉添加量、綠豆粉添加量、發(fā)酵時間兩兩之間的交互作用不顯著。

利用響應面軟件進行計算分析可得出菌株A32食品級發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方和發(fā)酵條件為：高粱粉添加量4.6 g/100 mL，綠豆粉添加量2.9g/100 mL，發(fā)酵時間59.2 h。為驗證上述試驗結果的可靠性，在此最優(yōu)條件下對菌株A32 食品級發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配方和發(fā)酵條件進行驗證，做3 次平行試驗，得出菌株A32 發(fā)酵液對S.aureus 的抑菌圈直徑為（25.9±0.252） mm，與預測值都十分相近，說明模型方程與實際情況擬合較好，具有可靠的現(xiàn)實意義。因此確定高粱粉添加量4.7 g/100mL，綠豆粉添加量3.0 g/100mL，NaCl 添加量1 g/100mL，發(fā)酵時間為60 h，發(fā)酵初始pH6，搖床轉速140 r/min，即可保證能夠得到較高產(chǎn)量的細菌素。

3 結論

通過對菌株A32 食品級培養(yǎng)基原料的篩選，得到其最佳碳源為高粱粉、氮源為綠豆粉；在單因素試驗的基礎上通過PB 試驗和響應面試驗對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到菌株A32 產(chǎn)細菌素能力最佳的發(fā)酵條件為：高粱粉添加量4.7 g/100mL，綠豆粉添加量3.0 g/100mL，NaCl 添加量1 g/100mL，發(fā)酵時間60 h，發(fā)酵初始pH6，搖床轉速140 r/min。