張國(guó)勇 曲 萍 鄧自新* 董培智 崔生輝

（1山西省食品藥品檢驗(yàn)所，山西太原 030031）

（2中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基（BPW） 是一種非選擇性增菌培養(yǎng)基，可用于沙門(mén)氏菌預(yù)增菌培養(yǎng)。該培養(yǎng)基配方中添加蛋白胨為微生物提供碳源與氮源，其他無(wú)機(jī)鹽維持培養(yǎng)基滲透壓。國(guó)內(nèi)外對(duì)緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基的研究主要比較不同廠家培養(yǎng)基對(duì)沙門(mén)氏菌預(yù)增菌效果的影響，以及在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的沙門(mén)氏菌預(yù)增菌試驗(yàn)。Han 利用吸光度和平板計(jì)數(shù)法比較8 種廠家培養(yǎng)基對(duì)沙門(mén)氏菌預(yù)增菌效果的影響；

Weng 等以緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入適合濃度的促進(jìn)劑、抑制劑以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)制成共增菌培養(yǎng)基SSSV；Gao 利用50 株菌評(píng)價(jià)即用型緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基的靈敏度和特異性。Beckers P 比較了緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基和TBB 培養(yǎng)基在檢測(cè)沙門(mén)氏菌及腸桿菌中的預(yù)增菌效果。目前，緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基（BPW） 用到的蛋白胨、牛肉膏、酵母粉等復(fù)雜成分，來(lái)源不明，加工工藝混亂，缺乏統(tǒng)一的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致成品的批間差異較大，可變因素多，質(zhì)量難以控制，且存在引入外源性病毒的安全隱患，進(jìn)而影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，研制由分子結(jié)構(gòu)清晰、可溯源的純化學(xué)合成食品微生物參比培養(yǎng)基，構(gòu)建客觀、準(zhǔn)確、可操作性強(qiáng)的培養(yǎng)基評(píng)價(jià)體系，勢(shì)在必行。

純化學(xué)合成培養(yǎng)基（Chemically Defined Culture Medium） 由已知分子結(jié)構(gòu)和純度的化學(xué)成分配制而成。純化學(xué)合成培養(yǎng)基用化學(xué)成分替代了天然成分，質(zhì)量穩(wěn)定可靠。目前，純化學(xué)合成培養(yǎng)基已廣泛用于提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量，I.A.El-Kady 等用純化學(xué)培養(yǎng)基發(fā)酵葡萄穗霉使維魯卡林J 產(chǎn)量提高到11.8 mg/L；Hyun-Koo Nam 等將甘油加入到含氨基酸的純化學(xué)合成培養(yǎng)基中，發(fā)酵重組基因的大腸桿菌DH5a，提高了β-胡蘿卜素產(chǎn)量。純化學(xué)合成培養(yǎng)基亦可增加細(xì)菌生長(zhǎng)量，Angela Restrepo 等探究純化學(xué)合成培養(yǎng)基對(duì)巴西副球菌生長(zhǎng)量的影響；Kadri Aller 等配制純化學(xué)培養(yǎng)基培養(yǎng)乳糖乳桿菌IL1403，結(jié)果表明谷氨酰胺、天冬氨酸有利于乳糖乳桿菌的生長(zhǎng)，同時(shí)支鏈氨基酸可以提高細(xì)菌生長(zhǎng)率；Yu Chen 等開(kāi)發(fā)優(yōu)化了可促進(jìn)凝結(jié)芽胞桿菌高密度生長(zhǎng)的純化學(xué)合成培養(yǎng)基；VartanovaNO 等合成一種新布魯氏菌培養(yǎng)基培養(yǎng)幽門(mén)螺旋桿菌，除加入血紅蛋白外，培養(yǎng)基中還加入鐵離子、谷氨酰胺保證幽門(mén)螺旋桿菌生長(zhǎng)。還有關(guān)于細(xì)菌快速檢測(cè)純化學(xué)合成培養(yǎng)基的報(bào)道，F(xiàn)eng 等根據(jù)大腸桿菌發(fā)酵乳酸產(chǎn)酸產(chǎn)氣的特性開(kāi)發(fā)了純化學(xué)合成培養(yǎng)基，用于快速檢測(cè)大腸桿菌。

根據(jù)國(guó)標(biāo)GB 4789.28—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑》的質(zhì)量要求，緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基的質(zhì)控菌株為鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028 菌株。采用非選擇性分離和計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基的目標(biāo)菌生長(zhǎng)率定量測(cè)試方法，在鹽溶液的基礎(chǔ)上，添加多種氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽多次重復(fù)篩選出可以促進(jìn)鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028 生長(zhǎng)的物質(zhì)，合成新的純化學(xué)緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)菌株：鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium，ATCC14028），-80 ℃冰箱保藏，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂、MH 培養(yǎng)基、腦心浸出液培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯，北京三藥科技公司；緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基，美國(guó)BD 公司。

試劑：氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽等，Sigma 公司。葡萄糖鹽溶液：葡萄糖4.0 g/L、磷酸氫二鈉6.78 g/L、磷酸二氫鉀3.0 g/L、氯化鈉0.5 g/L、氯化銨1.0 g/L。

儀器：法國(guó)梅里埃高智能全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)VITEK2；Thermo 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀Multiskan GO 等。

1.2 菌懸液制備

將鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028 在腦心浸出液培養(yǎng)基中活化，36 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，取新鮮過(guò)夜菌液涂布于MH 瓊脂培養(yǎng)基，36 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，取MH 平板上培養(yǎng)過(guò)夜的二代沙門(mén)氏菌新鮮培養(yǎng)物，用棉簽刮取至無(wú)菌生理鹽水中，調(diào)制McFarland 值為1.0 左右的菌懸液，用無(wú)菌水稀釋1 000 倍，備用。

1.3 細(xì)菌OD600 值的測(cè)定

將細(xì)菌36 ℃培養(yǎng)4 h、24 h、48 h 后，將96 孔板培養(yǎng)物置于混懸儀懸1 min～2 min，反復(fù)顛倒混勻待其膜上無(wú)水汽，迅速置于酶標(biāo)儀測(cè)量600 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.4 單個(gè)成分篩選

用葡萄糖鹽溶液作溶劑，將每種單一成分配制成高中低3 種不同質(zhì)量濃度的溶液，具體見(jiàn)下頁(yè)表1。在96 孔板中按比例逐一添加各種溶液，每種物質(zhì)設(shè)置3 種濃度梯度，每個(gè)濃度重復(fù)3 個(gè)孔，再加入上述菌懸液使得最終濃度達(dá)到103CFU～104CFU，用96 孔板封膜封板，36 ℃培養(yǎng)。

1.5 7 種物質(zhì)基礎(chǔ)上篩選

在7 種有效成分（甲硫氨酸、維生素C、胱氨酸二鹽酸鹽、半胱氨酸、硫酸腺嘌呤、硫酸鎂、硫酸錳） 的混合液基礎(chǔ)上逐一添加其余39 種成分進(jìn)行第二輪篩選。用葡萄糖鹽溶液作溶劑，將篩選的7 種成分按最適濃度混合，配制成混合液，在此基礎(chǔ)上添加39 種物質(zhì)，每個(gè)物質(zhì)設(shè)置3 個(gè)濃度，每個(gè)濃度重復(fù)3 個(gè)孔，每孔中加入適量菌懸液使得最終濃度達(dá)到103 CFU～104 CFU，用96 孔板封膜封板，36 ℃培養(yǎng)。

表1 單個(gè)成分及其質(zhì)量濃度

1.6 8 種物質(zhì)中有效成分篩選

篩選出8 種成分（甲硫氨酸、維生素C、胱氨酸二鹽酸鹽、半胱氨酸、硫酸腺嘌呤、硫酸鎂、黃嘌呤、硫酸錳） 進(jìn)行最適物質(zhì)篩選。分別用葡萄糖鹽溶液做溶劑，配制溶液方法如表2 所示。

表2 混合物質(zhì)配制方法

1.7 自制純化學(xué)培養(yǎng)基與市售培養(yǎng)基比較

根據(jù)之前試驗(yàn)結(jié)果，按照配方（葡萄糖4 g/L、硫酸鎂0.05 g/L、磷酸氫二鈉6.78 g/L、磷酸二氫鉀3.0 g/L、氯化鈉0.5 g/L、氯化銨1.0 g/L） 制成純化學(xué)合成緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基，與市售BPW 培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯做對(duì)比，在96 孔板中按比例逐一添加各種溶液，每種物質(zhì)設(shè)置3 種濃度梯度，每個(gè)濃度重復(fù)3 個(gè)孔，每孔中加入適量菌懸液，使得最終濃度達(dá)到103CFU～104CFU，用96 孔板封膜封板，36 ℃培養(yǎng)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0 軟件單因素方差中的LSD 多重比較法，使用Excel 2010 和GraphPad 7.0分析數(shù)據(jù)及制表繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單個(gè)成分篩選結(jié)果

葡萄糖鹽溶液作為對(duì)照組，添加氨基酸、維生素以及無(wú)機(jī)鹽等46 種成分分別配制成高中低不同質(zhì)量濃度溶液，逐一篩選出對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌有促生長(zhǎng)作用的7 種物質(zhì)，且7 種物質(zhì)質(zhì)量濃度與促生長(zhǎng)能力相關(guān)。7 種物質(zhì)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)影響結(jié)果如圖1所示。由圖1 可知，硫酸鎂、胱氨酸二鹽酸鹽高濃度與中濃度、低濃度在促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)方面存在差異（P<0.05），兩者中濃度與低濃度無(wú)差異，且低濃度硫酸鎂、胱氨酸二鹽酸鹽效果好；維生素C 中濃度與高、低濃度在促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)方面存在差異（P<0.05），故中濃度維生素C 效果好；硫酸錳高濃度與中濃度在細(xì)菌生長(zhǎng)方面存在差異（P<0.05），低濃度與高、中濃度無(wú)差異，選用低濃度硫酸錳；甲硫氨酸、半胱氨酸、硫酸腺嘌呤的高中低3 種濃度均無(wú)差異，故低濃度較宜。

圖1 7 種有效成分不同濃度對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028生長(zhǎng)影響

最適濃度的7 種物質(zhì)對(duì)沙門(mén)氏菌促生長(zhǎng)能力比較結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可知，與對(duì)照組相比，7 種物質(zhì)對(duì)細(xì)菌促生長(zhǎng)能力存在差異（P<0.05）；其中低濃度硫酸鎂與對(duì)照組存在顯著性差異（P<0.01）；分析得知，低濃度硫酸鎂對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028 生長(zhǎng)影響較大；其余6 種物質(zhì)甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸二鹽酸鹽、維生素C、硫酸腺嘌呤、硫酸錳均促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)，但影響較弱。

圖2 最適濃度的7 種有效成分對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028 生長(zhǎng)影響

7 種最適濃度物質(zhì)對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)影響如圖3 所示。由圖3 可知，培養(yǎng)4 h 后，7 種物質(zhì)均無(wú)明顯生長(zhǎng)，培養(yǎng)24 h 時(shí)硫酸鎂培養(yǎng)的細(xì)菌OD600值達(dá)到0.35，甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、硫酸腺嘌呤、硫酸錳培養(yǎng)的細(xì)菌OD600值達(dá)到0.18，維生素C 培養(yǎng)的細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，48 h 后OD600值才達(dá)到0.15，培養(yǎng)48 h 后甲硫氨酸培養(yǎng)的細(xì)菌開(kāi)始進(jìn)入衰亡期，其余6 種物質(zhì)培養(yǎng)的細(xì)菌均有所增長(zhǎng)，且生長(zhǎng)緩慢。

圖3 最適濃度的多種有效成分對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028 生長(zhǎng)曲線

2.2 7 種物質(zhì)基礎(chǔ)上的篩選結(jié)果

為了探究2 種或者多種物質(zhì)聯(lián)合是否會(huì)促進(jìn)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)，在46 種物質(zhì)篩選的7 種有效成分（甲硫氨酸、維生素C、胱氨酸二鹽酸鹽、半胱氨酸、硫酸腺嘌呤、硫酸鎂、硫酸錳） 混合液基礎(chǔ)上逐一添加39 種成分進(jìn)行第二輪篩選。通過(guò)試驗(yàn)在7 種有效成分的基礎(chǔ)上篩選出促進(jìn)鼠傷寒沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)的有效成分黃嘌呤，不同質(zhì)量濃度黃嘌呤的添加對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)的影響結(jié)果如圖4所示。由圖4 可知，7 種物質(zhì)均存在作為對(duì)照組時(shí)，細(xì)菌OD600值（0.2～0.23） 較僅有硫酸鎂時(shí)細(xì)菌OD600值（0.35） 的情況下較低，當(dāng)加入黃嘌呤時(shí)細(xì)菌OD600值均可達(dá)0.25 左右，組內(nèi)方差分析表明，高濃度與中、低濃度存在差異（P<0.05），其中高濃度黃嘌呤培養(yǎng)的細(xì)菌OD600值可達(dá)0.3。結(jié)果分析表明，7 種物質(zhì)存在的條件下，黃嘌呤可以促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)，且高濃度黃嘌呤效果較好。

圖4 不同濃度的黃嘌呤對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028 生長(zhǎng)影響

高濃度黃嘌呤對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028生長(zhǎng)曲線如圖5 所示。由圖5 可知，當(dāng)培養(yǎng)4 h 后，加有黃嘌呤溶液與對(duì)照組在細(xì)菌濁度無(wú)明顯差別，24 h 時(shí)黃嘌呤培養(yǎng)的細(xì)菌OD600值已達(dá)到0.3，對(duì)照組7 種物質(zhì)培養(yǎng)的細(xì)菌OD600值達(dá)到0.2，兩者存在差異（P<0.05）；48h 試驗(yàn)組OD600值有所上升；7種物質(zhì)OD600值稍有下降。試驗(yàn)表明：培養(yǎng)48 h 后，7 種混合物質(zhì)存在的情況下，高濃度黃嘌呤可以促進(jìn)鼠傷寒沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)。

圖5 高濃度黃嘌呤對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028 生長(zhǎng)曲線

2.3 8 種物質(zhì)中有效成分篩選結(jié)果

在7 種物質(zhì)基礎(chǔ)上從39 種物質(zhì)中篩選出可以促進(jìn)沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)的黃嘌呤，結(jié)合以上結(jié)果，在促鼠傷寒沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)的8 種物質(zhì)（甲硫氨酸、維生素C、胱氨酸二鹽酸鹽、半胱氨酸、硫酸腺嘌呤、硫酸鎂、硫酸錳、黃嘌呤） 中，硫酸鎂促進(jìn)效果最佳，黃嘌呤在多種物質(zhì)基礎(chǔ)上發(fā)揮作用，故將硫酸鎂、黃嘌呤與其余6 種物質(zhì)配制成6 組混合溶液進(jìn)行試驗(yàn)，探究硫酸鎂、黃嘌呤、6 種物質(zhì)的促生長(zhǎng)作用。

進(jìn)一步探究硫酸鎂、黃嘌呤、6 種物質(zhì)（甲硫氨酸、維生素C、胱氨酸二鹽酸鹽、半胱氨酸、硫酸腺嘌呤、硫酸錳） 中有效成分，配制溶液1（硫酸鎂）、溶液2（硫酸鎂+6 種物質(zhì)）、溶液3（6 種物質(zhì)）、溶液4（8 種物質(zhì)）、溶液5（黃嘌呤）、溶液6（黃嘌呤+6 種物質(zhì)） 進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 不同混合溶液對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028 生長(zhǎng)影響

由圖6 可知，與對(duì)照組相比，溶液2 培養(yǎng)的細(xì)菌OD600值存在差異（P<0.05）；與對(duì)照組相比，溶液1、溶液4 培養(yǎng)的細(xì)菌OD600值存在顯著性差異（P<0.01）；溶液1、溶液4 以及溶液2 試驗(yàn)結(jié)果表明，硫酸鎂單獨(dú)存在時(shí)，促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)的效果最佳；八種物質(zhì)也可促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)，效果次之；硫酸鎂和6 種物質(zhì)存在時(shí)，效果一般；進(jìn)一步分析得出，硫酸鎂存在時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)良好，缺乏硫酸鎂時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)不佳，可見(jiàn)硫酸鎂能有效促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)。

硫酸鎂、黃嘌呤、6 種物質(zhì)（甲硫氨酸、維生素C、胱氨酸二鹽酸鹽、半胱氨酸、硫酸腺嘌呤、硫酸錳） 配制的6 種混合溶液對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)影響結(jié)果如圖7 所示。

圖7 有效成分對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028 生長(zhǎng)曲線

由圖7 可知，當(dāng)培養(yǎng)4 h 時(shí)，各種物質(zhì)均生長(zhǎng)且無(wú)明顯差異；培養(yǎng)至24 h 時(shí)溶液1 細(xì)菌OD600值達(dá)0.35，溶液4 培養(yǎng)的細(xì)菌OD600值達(dá)0.3，溶液2培養(yǎng)的細(xì)菌OD600值達(dá)0.18；48 h 時(shí)細(xì)菌OD600值均有所上升。試驗(yàn)表明，硫酸鎂在鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028 生長(zhǎng)過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，硫酸鎂在BPW 培養(yǎng)基中必不可少。

2.4 自制純化學(xué)培養(yǎng)基與市售培養(yǎng)基對(duì)比

根據(jù)GB4789.28 中蛋白胨水培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行研制，將50 mg/L 硫酸鎂加入鹽溶液中制成純化學(xué)合成培養(yǎng)基S-BPW 1（硫酸鎂）、S-BPW 2（七水硫酸鎂），與市售培養(yǎng)基緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基（BPW）、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB） 進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，葡萄糖鹽溶液作為對(duì)照組，結(jié)果如圖8 所示。

圖8 自制純化學(xué)培養(yǎng)基與市售培養(yǎng)基對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028 生長(zhǎng)影響比較

由圖8 可知，S-BPW 1 和S-BPW 2 培養(yǎng)的細(xì)菌OD600 值均高于市售緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基（BPW）、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB），2 組自制培養(yǎng)基與市售緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基存在差異（P<0.05），自制純化學(xué)合成緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基在促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)方面已達(dá)到市售緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基效果。

純化學(xué)合成緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基與市售培養(yǎng)基對(duì)比生長(zhǎng)曲線如圖9 所示。由圖9 可知，培養(yǎng)4 h時(shí)各培養(yǎng)基無(wú)生長(zhǎng)，培養(yǎng)24 h 后，市售緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基（BPW）、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）、自制純化學(xué)培養(yǎng)基（S-BPW-1、S-BPW-2） 中細(xì)菌OD600值均達(dá)到0.35，48h 后市售緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基（BPW）、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）、自制純化學(xué)培養(yǎng)基（S-BPW-1、S-BPW-2） 細(xì)菌OD600值均有所上升。結(jié)果表明，培養(yǎng)48 h 后自制純化學(xué)培養(yǎng)基符合國(guó)標(biāo)緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基（BPW） 標(biāo)準(zhǔn)。

圖9 自制純化學(xué)培養(yǎng)基與市售培養(yǎng)基對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028 生長(zhǎng)曲線比較

無(wú)水硫酸鎂與七水硫酸鎂在細(xì)菌生長(zhǎng)方面的差異如圖10 所示。

圖10 不同形式硫酸鎂對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028 生長(zhǎng)影響

溶液1（硫酸鎂） 與溶液7（七水硫酸鎂）、溶液2（硫酸鎂和6 種物質(zhì)） 與溶液8（七水合硫酸鎂和6 種物質(zhì)） 培養(yǎng)的細(xì)菌OD600值無(wú)差異（P>0.05），溶液4（硫酸鎂配制的八種混合物質(zhì)）與溶液9（七水合硫酸鎂配制的八種混合物質(zhì)） 培養(yǎng)的細(xì)菌OD600值存在差異（P<0.05），硫酸鎂單獨(dú)培養(yǎng)的細(xì)菌OD600值最高，表明硫酸鎂與七水合硫酸鎂在細(xì)菌生長(zhǎng)方面無(wú)差異。培養(yǎng)至24 h，兩者培養(yǎng)的細(xì)菌OD600值達(dá)0.35，無(wú)明顯差異；硫酸鎂是否與水結(jié)合均對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)無(wú)影響。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其他成分與硫酸鎂混合后會(huì)影響細(xì)菌生長(zhǎng)，6 種物質(zhì)中哪種成分會(huì)降低硫酸鎂對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)影響還有待研究。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)在純化學(xué)培養(yǎng)基鹽溶液的基礎(chǔ)上添加氨基酸、維生素和無(wú)機(jī)鹽，篩選出對(duì)沙門(mén)氏菌有促生長(zhǎng)作用的有效成分，制成緩沖蛋白胨水（BPW） 純化學(xué)合成培養(yǎng)基。成分：葡萄糖4 g/L、硫酸鎂0.05 g/L、磷酸氫二鈉6.78 g/L、磷酸二氫鉀3.0 g/L、氯化鈉0.5 g/L、氯化銨1.0 g/L，pH7.2±0.2。該培養(yǎng)基能提供沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)24 h 的促生長(zhǎng)能力與市售緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基相當(dāng)，且其成分精確，具有良好的可溯源性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，質(zhì)量可控，可以作為參比培養(yǎng)基，為我國(guó)BPW 培養(yǎng)基的生產(chǎn)與檢定提供參考價(jià)值。

本試驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸二鹽酸鹽、硫酸腺嘌呤、維生素C、硫酸錳6 種物質(zhì)單獨(dú)存在均可有效促進(jìn)鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028 生長(zhǎng)，OD600值均可達(dá)到0.15～0.2，進(jìn)一步篩選，在6 種物質(zhì)和硫酸鎂共同存在時(shí)，OD600值達(dá)到0.2，加入高濃度黃嘌呤后OD600值均可達(dá)到0.3。同樣Mickelson 提出無(wú)乳鏈球菌在純化學(xué)合成培養(yǎng)基生長(zhǎng)離不開(kāi)胱氨酸；C.Hong 用多種氨基酸制成純化學(xué)合成培養(yǎng)基研究嗜熱鏈球菌T1C2 不同生長(zhǎng)階段氨基酸消耗量以及必需量，表明半胱氨酸是嗜熱鏈球菌T1C2 生長(zhǎng)的必需氨基酸，占總需量的11%，半胱氨酸亦可促進(jìn)鼠傷寒沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)。當(dāng)黃嘌呤加入6 種物質(zhì)和七水硫酸鎂溶液中，對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)明顯，與單獨(dú)加入硫酸鎂的培養(yǎng)基相當(dāng)。Meng 指出細(xì)菌體內(nèi)黃嘌呤經(jīng)黃嘌呤脫氫酶催化最終生成尿酸，此過(guò)程可能與菌體生長(zhǎng)的不同階段有關(guān)。不同的細(xì)菌對(duì)不同物質(zhì)敏感度存在差異，除硫酸鎂以外，甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸二鹽酸鹽、硫酸腺嘌呤、維生素C、硫酸錳6 種物質(zhì)均對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)有不同程度促進(jìn)作用。

值得注意的是，本試驗(yàn)中硫酸鎂單獨(dú)培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，OD600值為0.35，表明硫酸鎂在細(xì)菌生長(zhǎng)中起到關(guān)鍵作用。Rui 等利用微量呼吸測(cè)壓法等技術(shù)探究硫酸鎂對(duì)損傷菌修復(fù)的影響，發(fā)現(xiàn)硫酸鎂對(duì)大腸桿菌，特別是損傷大腸桿菌有促進(jìn)修復(fù)的作用。硫酸鎂對(duì)不同細(xì)菌生長(zhǎng)亦有促進(jìn)作用，Tesh M J 發(fā)現(xiàn)七水硫酸鎂在化學(xué)合成培養(yǎng)基中促進(jìn)嗜肺軍團(tuán)菌生長(zhǎng)，濃度在80 μmol/L 時(shí)效果最佳，同時(shí)也需要氯化鉀的參與。硫酸鎂對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)具有較大影響，尤其在培養(yǎng)含氮物質(zhì)及氨基酸缺乏時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)硫酸鎂的需求增加，且革蘭氏陽(yáng)性菌對(duì)硫酸鎂需求較大。相關(guān)報(bào)道也指出硫酸鎂是三磷酸腺苷（ATP）參與線粒體反應(yīng)的輔助因子；鎂離子是除鉀離子外細(xì)胞含量最多的陽(yáng)離子，鎂離子會(huì)影響細(xì)胞膜離子通道；硫酸鎂還參與其他酶活反應(yīng)。

本試驗(yàn)用96 孔細(xì)胞培養(yǎng)基板進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，培養(yǎng)基容量較小，篩選出的有效物質(zhì)合成純化學(xué)合成培養(yǎng)基后進(jìn)行擴(kuò)大體系試驗(yàn)，結(jié)果不佳，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，推測(cè)可能是新合成的純化學(xué)培養(yǎng)基中關(guān)鍵物質(zhì)對(duì)擴(kuò)大體系敏感，相關(guān)問(wèn)題有待進(jìn)一步解決。本試驗(yàn)研究純化學(xué)合成培養(yǎng)基配方，探尋檢出沙門(mén)氏菌以及探究沙門(mén)氏菌最低生長(zhǎng)限度的營(yíng)養(yǎng)成分，可為我國(guó)食品安全抽檢承檢機(jī)構(gòu)微生物檢驗(yàn)工作提供參考。