倪國(guó)龍 張梓軒 焦鳳萍 林國(guó)亮

山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)公共衛(wèi)生學(xué)院，山東 泰安 271016

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤，其惡性程度高、治愈率低，病死率高達(dá)90%[1]。目前，HCC治療的首選方法仍是手術(shù)切除，但患者術(shù)后的復(fù)發(fā)率高，生存率也很低[2]。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)真菌多糖可以提高機(jī)體免疫力，并具有一定的抗腫瘤活性。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主、有序的死亡，涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等作用。目前認(rèn)為惡性腫瘤與細(xì)胞周期紊亂導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無(wú)限增生和凋亡減少有關(guān)。因此，抑制腫瘤細(xì)胞增生和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可能成為治療腫瘤的有效方法。Wnt信號(hào)通路由Wnt蛋白、Wnt蛋白受體和β-catenin等組成，Wnt/β-catenin信號(hào)通路與多種疾病密切相關(guān)，如可參與早期胚胎發(fā)育過(guò)程中腦和神經(jīng)系統(tǒng)的形成、參與造血干細(xì)胞的自我更新、維持小腸組織的穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)骨密度及脂肪細(xì)胞的分化等[3]。 Wnt/β-catenin信號(hào)通路還可通過(guò)激活下游的Cyclin D1和c-myc等影響細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程，從而可能和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。

本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)香菇菌糠多糖(polysaccharide extracted fromL.edodeswaste material，PLWM)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響,通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察香菇菌糠多糖對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響，采用Western blot檢測(cè)香菇菌糠多糖對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探索香菇菌糠多糖是否可通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡而可能發(fā)揮抗腫瘤作用，為開發(fā)抗肝癌輔助藥物提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料

香菇菌糠多糖由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)賈樂(lè)教授提供。細(xì)胞及培養(yǎng)基：HepG2細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，1%青霉素鏈霉素(1%PS)、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清FBS購(gòu)自泰安聯(lián)星科技有限公司。主要試劑：MTT等試劑購(gòu)自泰安華鵬生物科技有限公司，β-catenin、Caspase-3、Bcl-2和GAPDH等抗體購(gòu)自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1香菇菌糠多糖溶液配制 稱取香菇菌糠多糖粉末10 g,加入預(yù)熱的20 mL雙蒸水(約75℃左右)溶解1 h。室溫3 000 r/min離心15 min，輕輕吸上清，分別用0.45 μm和0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌。采用硫酸苯酚法測(cè)定多糖溶液的濃度，多糖溶液分成小包裝保存于-20 ℃冰箱中。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞使用DMEM(10%FBS,1%PS)培養(yǎng)基，在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)，0.25%胰酶消化進(jìn)行傳代，3～4天傳代1次。

1.2.3MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)香菇菌糠多糖對(duì)細(xì)胞的毒性 將HepG2細(xì)胞鋪至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，5×103個(gè)細(xì)胞/孔，過(guò)夜培養(yǎng)。加入香菇菌糠多糖溶液，終濃度為：6.25、12.5、25、50、100和200 μg/mL，每個(gè)濃度梯度各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,用預(yù)溫的PBS清洗細(xì)胞2次，再按上述終濃度加入香菇菌糠多糖，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，向細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清后，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，避光、室溫震蕩10 min。酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度(A490 nm)。

1.2.4MTT法檢測(cè)香菇菌糠多糖對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制情況 將HepG2細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞約2×104個(gè)，培養(yǎng)18～24 h后加入香菇菌糠多糖溶液，使其終濃度為50 μg/mL，同時(shí)以細(xì)胞培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，每組6個(gè)復(fù)孔。在24、48、72、96和120 h后分別加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清后，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，避光、室溫震蕩10 min。酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度(A490)，并依據(jù)公式：細(xì)胞存活率(%)=A給藥/A對(duì)照×100%計(jì)算細(xì)胞的存活率。

1.2.5細(xì)胞形態(tài)觀察香菇菌糠多糖對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 將HepG2細(xì)胞分別以每孔1×103個(gè)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)過(guò)夜。加入香菇菌糠多糖溶液，終濃度為50 μg/mL，以細(xì)胞培養(yǎng)液為陰性對(duì)照組，以DOX(10 μmol/L)為陽(yáng)性對(duì)照組。培養(yǎng)72 h后觀察細(xì)胞形態(tài)，以判斷香菇菌糠多糖是否可促進(jìn)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡。

1.2.6Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá) 將HepG2細(xì)胞按每孔2×105個(gè)接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)18 h后，加入香菇菌糠多糖溶液，使其終濃度為50 μg/mL，培養(yǎng)液為陰性對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,采用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌3次，收集細(xì)胞沉淀，提取蛋白并采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。配制膠板，每孔上樣量為40 μg，采用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，1∶1 000稀釋的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌后換HRP標(biāo)記1∶5 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h。PBST洗滌3次，每次10 min。化學(xué)發(fā)光成像儀顯影，檢測(cè)β-catenin、Caspase-3和Bcl-2蛋白的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，劑量依賴效應(yīng)采用線性回歸分析方法，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的組間比較采用單因素重復(fù)測(cè)量的方差分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 香菇菌糠多糖對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性檢測(cè)

表1 藥物濃度與吸光度指數(shù)分布擬合回歸分析

圖1 香菇菌糠多糖對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性檢測(cè)

2.2 香菇菌糠多糖對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用

采用MTT法檢測(cè)香菇菌糠多糖(PLWM)對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用，對(duì)時(shí)間效應(yīng)(F=56.664,P<0.001)，組間比較(F=572.991,P<0.001)，兩因素的交互作用(F=39.150，P<0.001)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示50 μg/mL的香菇菌糠多糖具有明顯抑制細(xì)胞增殖的作用，見(jiàn)表2，圖2。

表2 陰性對(duì)照組與50 μg/mL的香菇菌糠多糖處理組數(shù)據(jù)的重復(fù)測(cè)量分析

圖2 香菇菌糠多糖抑制HepG2細(xì)胞增殖的作用

2.3 香菇菌糠多糖對(duì)HepG2細(xì)胞的影響

我們也觀察了香菇菌糠多糖對(duì)HepG2細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與陰性對(duì)照組相比，50 μg/mL香菇菌糠多糖可使HepG2細(xì)胞發(fā)生明顯皺縮，細(xì)胞皺縮形態(tài)與10 μmol/L DOX處理組相似，見(jiàn)圖3，表明香菇菌糠多糖可能具有促進(jìn)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用。

圖3 香菇菌糠多糖對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響(×100)

2.4 香菇菌糠多糖對(duì)Wnt/βcatenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

我們采用Western blot檢測(cè)香菇菌糠多糖對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中β-catenin、Caspase-3和Bcl-2表達(dá)的影響。在HepG2細(xì)胞中，香菇菌糠多糖可明顯抑制β-catenin、Caspase-3和Bcl-2的蛋白表達(dá)量，見(jiàn)圖4。結(jié)果表明香菇菌糠多糖可能會(huì)通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路及其下游的Bcl-2促進(jìn)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖4 Western blot檢測(cè)香菇菌糠多糖對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

3 討 論

Wnt/β-catenin是Wnt信號(hào)通路中的經(jīng)典通路，它參與了多種細(xì)胞的生命活動(dòng)，包括組織器官的再生、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和壞死等，并且Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。

真菌多糖作為藥物研究始于上世紀(jì)中期，通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用。陳瑾歆等[6]發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可通過(guò)抑制Bcl-2表達(dá)而促進(jìn)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，呂君等[7]也發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可通過(guò)下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游Bcl-2的表達(dá)促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡。靈芝多糖可通過(guò)Erk信號(hào)途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖[8]，香菇多糖也可通過(guò)激活T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等活性及增強(qiáng)免疫細(xì)胞的吞噬能力發(fā)揮抗腫瘤作用[9]，枸杞多糖能明顯促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌IL-1、IL-2，巨噬細(xì)胞釋放TNF等細(xì)胞因子，激活腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答[10]。

目前已有香菇多糖片用作慢性乙型肝炎和消化道腫瘤的放、化療輔助藥。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)香菇菌糠多糖具有抗HBV的作用[11]。為進(jìn)一步開發(fā)利用香菇菌糠多糖，發(fā)揮其藥用價(jià)值，本項(xiàng)目通過(guò)體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)50 μg/mL的香菇菌糠多糖具有明顯的抑制細(xì)胞增殖作用，可使HepG2細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯皺縮，說(shuō)明香菇菌糠多糖可能通過(guò)促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抑制HepG2細(xì)胞增殖的作用。同時(shí)我們通過(guò)Western blot方法檢測(cè)香菇菌糠多糖對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路及其下游分子的影響，發(fā)現(xiàn)香菇菌糠多糖可抑制β-catenin、Caspase-3和Bcl-2蛋白的表達(dá)量，表明香菇菌糠多糖可能通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路及其下游的Bcl-2來(lái)促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡，從而起到抗腫瘤的作用。