張 鵬 張松林 孫來龍

(三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 胸心外科，湖北 宜昌 443003)

心臟移植物血管病(cardiac allograft vasculopathy，CAV)是影響移植后心臟長期存活的主要因素，是免疫因素和非免疫因素共同介導(dǎo)的心臟慢性排斥反應(yīng)，主要表現(xiàn)為以血管平滑肌細胞增殖為主的新生內(nèi)膜形成和移植物血管的進行性增厚，最終導(dǎo)致管腔狹窄，移植物功能衰竭[1]。傳統(tǒng)大鼠心臟腹腔移植模型的建立，是通過血管的端側(cè)吻合，血流從腹主動脈經(jīng)冠狀動脈-冠狀竇口到右心房，再從右心室泵出到腹腔靜脈，由于左心房和左心室工作較少，所以移植心臟不久會萎縮[2]。且這種腹腔心臟異位移植，需要血管的端側(cè)吻合，操作技術(shù)要求高。血管套管的替代使用可使模型的建立更加簡便，但套管的穩(wěn)固、移植放入和能否避免套管內(nèi)血管產(chǎn)生褶皺是成功的關(guān)鍵[3]。我們在以往套管模型的基礎(chǔ)上，通過翻轉(zhuǎn)后血管的對稱吻合和單側(cè)打結(jié)固定以及半針管的運用，使血管套管更加穩(wěn)固，移入更加方便，期望能成功誘導(dǎo)出同種異體移植物血管病的病理損傷，為心臟慢性排斥反應(yīng)的干預(yù)研究提供理想的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體重300～330 g，購自三峽大學(xué)實驗動物中心[SCXK(鄂) 2017-0012]；SPF級雄性Wistar大鼠，體重120～150 g ，購自湖北省實驗動物研究中心[SCXK(鄂)2015-0018]。大鼠飼養(yǎng)溫度為(23±2)℃，相對濕度為(55±5)%，自由飲食。實驗操作在三峽大學(xué)實驗動物中心屏障實驗室[SYXK(鄂)2017-0061]進行，并遵循實驗動物的“3R”原則給予人文關(guān)懷。

1.2 實驗器材與藥品試劑

顯微外科器械包(卓越醫(yī)療器械)，XTL-165雙目外科顯微鏡( 江西鳳凰光學(xué)股份有限公司)，16 G靜脈留置針(貝朗醫(yī)療上海國際貿(mào)易有限公司)，20 G靜脈留置針(江西豐臨醫(yī)用器械有限公司)，8-0、9-0顯微帶線縫合針(寧波醫(yī)用縫針有限公司)，3-0真絲非吸收縫線(揚州市金環(huán)醫(yī)療器械廠)，玻璃培養(yǎng)皿(60 mm)，半針管筆尖(0.5 mm)，撐開器(16 cm)，玻璃分針13 cm。肝素鈉(北京亞米生物科技有限公司)，戊巴比妥鈉(上海化學(xué)試劑公司)，4%多聚甲醛固定液，蘇木素-伊紅染液(武漢谷歌生物科技)，α-平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)兔抗鼠單克隆抗體，增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)兔抗鼠單克隆抗體(武漢三鷹)，HRP標記的山羊抗兔鼠通用(DAKO公司)。

1.3 實驗分組與結(jié)果測定

實驗動物分為兩組，以Wistar大鼠為供體及空白對照組(n=17)，SD大鼠為受體及模型組(n=34)。成功建模30只，隨機分為7 d組、28 d組和56 d組，每組10只。取動脈標本后，每組隨機選取6只，常規(guī)HE染色和免疫組織化學(xué)α-SMA和PCNA染色。采用Image-pro plus 6.0軟件測量彈性纖維平面到內(nèi)膜邊緣的平均距離，代表移植動脈的內(nèi)膜厚度(n=6)；以棕黃色為陽性表達，測量免疫組織化學(xué)染色的積分光密度值(integrated optical density，IOD)。

1.4 套管制作

取16 G靜脈留置針管切去尖端，顯微鏡下切取約4 mm的管長，使兩端光滑、平整。顯微鏡下剪取直徑相當?shù)墓w動脈約7 mm。用顯微鑷使供體動脈穿過切取的16 G小管，取20 G靜脈留置針切去多余部分，生理鹽水潤濕針管，緩慢插入小管內(nèi)的供體動脈中。調(diào)整小管兩端動脈使之等長，放入60 mm的玻璃培養(yǎng)皿中(圖1A)。8-0顯微帶線縫合針對稱穿過小管兩端動脈，針邊距約1 mm，反向牽拉縫線使動脈翻轉(zhuǎn)，一側(cè)打結(jié)固定(圖1B)。殘留線端不超出小管邊緣，對稱側(cè)同樣操作，留適當長度后，纏繞小管一端兩圈再打結(jié)固定，同樣殘留線端不超出小管邊緣，使供體動脈完全包裹小管，制成動脈套管(圖1C)，放4℃生理鹽水中保存。

1.5 供體手術(shù)

以Wistar大鼠為供體，術(shù)前腹腔注射肝素鈉生理鹽水(5 mg/kg)，腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)。待麻醉后，胸腹部剃毛備皮，四肢固定于解剖臺上，碘伏胸腹部局部消毒，取尿道口上約3 cm至劍突下腹正中切口，剪開皮膚及肌肉等組織。暴露腹腔臟器，將胃和腸管牽拉置于腹部左側(cè)，打開后腹膜，找到腹主動脈和下腔靜脈，紗布墊于其上，用剪刀剪斷腹主動脈及下腔靜脈，直至血液放盡。沿膈肌和腋中線兩側(cè)剪開胸壁，將胸壁上翻，暴露胸腔臟器，剪除心肺、胸腺和食管等組織，可見沿脊柱走形的胸主動脈。在主動脈弓處離斷分支血管，剪除周圍組織及肋間動脈，分離胸主動脈至膈肌處，肝素鈉生理鹽水反復(fù)沖洗管腔。顯微鏡下剝脫動脈外層脂肪組織，修剪肋間動脈保留斷端約1 mm(動脈彈性回縮，防止血液漏出)，置于4℃生理鹽水中，以備套管制作。

1.6 受體手術(shù)

以SD大鼠為受體，術(shù)前禁食12 h，自由飲水，麻醉及腹部切口同供體手術(shù)。開腹后用撐開器固定，牽拉胃及腸管于左腹外側(cè)，無菌紗布覆蓋，溫鹽水潤濕。打開后腹膜，暴露腹腔動脈，用顯微鑷小心游離腎動脈平面下方約15 mm、髂動脈分叉處上方約5 mm的腹主動脈，動脈夾夾閉游離動脈的最上端、最下端(圖1D)。在上端動脈夾下方約5 mm處，顯微剪剪開動脈前壁約1/3周徑血管，取供體動脈套管置于半針管上(圖1E)，打結(jié)固定一端朝向外側(cè)，輕提剪口處平行插向遠心端，待完全插入改用玻璃分針彎部尖端完全送入動脈中。9-0顯微針線縫合剪口中央點管壁全層一針，打結(jié)后做牽引，再縫合其兩邊剪口，先開放遠心端動脈夾，無漏血后再開放近心端動脈夾。少量滲血可用紗布輕壓迫或加針縫合出血處，無血液滲出后觀察遠端血管是否充盈通暢(圖1F)。溫生理鹽水沖洗局部動脈，將胃及腸管復(fù)位，注入肝素鈉生理鹽水(5 mg/kg)，3-0絲線連續(xù)縫合肌肉、皮膚層關(guān)腹，碘伏消毒后，放保溫墊上，待蘇醒后轉(zhuǎn)動物房。術(shù)后48 h，大鼠四肢能夠自由活動，大小便正常視為手術(shù)成功。

1.7 移植物摘取

術(shù)前腹腔注射肝素鈉生理鹽水(5 mg/kg)肝素化全身，麻醉等步驟同受體手術(shù)。打開腹腔及后腹膜，可見套管處被纖維結(jié)締組織包裹，在其上、下方阻斷動脈，剪去周圍組織取出包裹的套管，立即放血處死大鼠，肝素生理鹽水反復(fù)沖洗管腔，顯微鏡下剝離纖維組織，取出套管內(nèi)的移植動脈，鹽水沖洗后放入4%的多聚甲醛中固定，用于HE染色和免疫組化染色。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 移植時間

模型組34只，成功建模30只，成功率為88.24%。移植各環(huán)節(jié)所需時長如下：供體動脈準備(獲取、修剪)所需時長為(16±2) min，套管制作時間為(10±2) min，受體動脈分離(20±3)min，套管移植(6±2)min，動脈阻斷時間(10±2)min。

2.2 移植動脈HE染色和內(nèi)膜厚度變化

分別取對照組、移植后7 d組、28 d組、56 d組動脈行HE染色。與對照組相比，7 d組動脈內(nèi)皮細胞脫落，少量單核巨噬細胞浸潤(圖2A和2B)；28 d組動脈被大量單核巨噬細胞侵蝕，中膜彈性纖維斷裂(圖2C)；56 d組中膜彈性纖維排列紊亂，內(nèi)膜出現(xiàn)大量炎癥細胞，并向管腔中心延伸，形成多個狹小的管腔，管壁機化(圖2D)。與對照組比較，7 d組、28 d組和56 d組內(nèi)膜厚度顯著增加(均P<0.01)；與7 d組比，28 d組內(nèi)膜厚度增加顯著(P<0.01)；與28 d組相比，56 d組內(nèi)膜厚度顯著增加(P<0.01)。此結(jié)果提示，隨時間的增加，動脈內(nèi)膜厚度不斷增加(圖2E)。

2.3 移植動脈α-SMA和PCNA表達情況

免疫組化觀察α-SMA和PCNA表達情況(圖3A)。結(jié)果顯示，正常對照組血管平滑肌細胞中高表達α-SMA、低表達PCNA，7 d組、28 d組和56 d組α-SMA的表達范圍和強度明顯減少，PCNA的表達量逐漸增加(均P<0.05)；且與7 d組比較，28 d組α-SMA的表達量明顯減少，PCNA的表達量明顯增加(均P<0.05)；與28 d組比較，56 d組α-SMA的表達量也顯著減少，PCNA的表達量顯著增加(均P<0.05)。提示隨時間的增加，α-SMA的表達量不斷減少，PCNA的表達量不斷增加(圖3B和3C)。

3 討論

除傳統(tǒng)腹腔移植外，小鼠頸部心臟移植同樣需要血管吻合，并存在小鼠頸總動脈、頸靜脈不在同一手術(shù)平面，供受體血管大小不匹配，術(shù)后血管吻合口扭轉(zhuǎn)或壓迫等缺點；隨著袖套技術(shù)的運用，簡化了移植部分的血管吻合，但袖套管的安置過程繁瑣，并延長了手術(shù)時間，并且預(yù)實驗成功率低，動物消耗多[2-5]。我們選擇了血管套管移植的替代模型，在比較以往大鼠動脈移植模型的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)血管翻轉(zhuǎn)后兩端打結(jié)固定，在插入動脈過程中容易脫落，而一旦脫落只能重新制作套管，增加了動脈阻斷時間和大鼠死亡風(fēng)險[6]。因此，本研究在其基礎(chǔ)上，借鑒了翻轉(zhuǎn)血管的兩端打結(jié)和對側(cè)縫合法[7]，建立了翻轉(zhuǎn)后血管的對稱吻合和單側(cè)打結(jié)固定法，而0.5 mm半針管筆尖結(jié)構(gòu)，在不損傷動脈套管的前提下，能更好地輔助套管的移植，使套管的放置更加方便、快捷。

共有34只大鼠采用本改進法行移植動脈手術(shù)，其中2只死于術(shù)后腹部開裂(大鼠對腹部切口刺激的撕咬)，1只夾閉腹腔動脈時心臟停跳(可能與腹腔生理鹽水過多、循環(huán)血量增多有關(guān))，1只術(shù)后下肢癱瘓(急性排斥或血栓形成)，最終成功建模30只，成功率達88.24%。套管制作時間雖延長，但易化了移植部分，預(yù)實驗成功率增高，減少了動物消耗。

在各時間點摘取動脈后，行HE染色發(fā)現(xiàn)，移植動脈在28 d，管壁被大量單核巨噬細胞侵蝕，中膜部分彈性纖維斷裂；在56 d內(nèi)膜增厚顯著，管腔機化。平滑肌細胞是CAV中新生內(nèi)膜的主要組成部分[8]。α-SMA是構(gòu)成平滑肌細胞收縮裝置的細胞結(jié)構(gòu)蛋白，在分化成熟的平滑肌細胞中高表達，當平滑肌細胞出現(xiàn)凋亡、纖維化或由“收縮型”轉(zhuǎn)換為“合成型”時，α-SMA表達量將減少[9-11]。本研究免疫組化觀察α-SMA表達及分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨時間增加，α-SMA的表達量逐漸減少，表明平滑肌細胞的收縮功能降低，并向分泌型細胞轉(zhuǎn)變。PCNA可評價平滑肌細胞重塑過程中的增殖狀態(tài)[12]。免疫組化觀察PCNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)隨時間增加，PCNA的表達逐漸增高，表明細胞增殖活躍，與動脈內(nèi)膜厚度的增加及管腔閉塞相對應(yīng)。α-SMA表達不斷減少和PCNA表達逐漸增加，表明平滑肌細胞經(jīng)歷了凋亡、增殖和表型轉(zhuǎn)變，最終導(dǎo)致大量平滑肌樣細胞在內(nèi)膜下的聚集，引起管腔閉塞性改變[13-15]。綜上所述，改進后的模型可有效誘導(dǎo)出移植動脈的CAV樣病理變化。

模型建立中，我們應(yīng)注意以下幾點：①供體Wistar大鼠重量超過150 g時，血管套管制作中容易出現(xiàn)褶皺，應(yīng)將體重控制在120～150 g，受體SD大鼠應(yīng)控制在320～350 g，低于320 g插管阻力大，超過350 g動脈分離困難、更易形成側(cè)支循環(huán)；②套管的切取長度可在顯微鏡下以半針管筆尖為參考，供體動脈切取以套管為參考，供體動脈全長可制作數(shù)個動脈套管以供移植或備用；③剪取的動脈應(yīng)比套管長約3 mm，動脈翻轉(zhuǎn)后，兩端對稱縫合，針邊距適當，減少中央隆起，使動脈有一定的緊張度，避免套管內(nèi)動脈褶皺的發(fā)生；④受體大鼠腹腔動脈的分離可從腎動脈平面下方開始，顯微鑷小心游離動脈側(cè)周圍組織，玻璃分針動脈下穿孔后，可一直游離到髂腰靜脈水平；⑤動脈夾夾閉后，如有血液持續(xù)從剪口處滲出，可在動脈夾處用絲線活結(jié)結(jié)扎，玻璃分針彎部尖端光滑、平整，用肝素生理鹽水潤濕后可擴增剪口，方便套管的插入。

綜上所述，此套管法的改良使制作的供體動脈套管更加穩(wěn)固，克服了受體動脈阻力高的情況，并且半針管的運用使套管移植過程更加簡便。同時，可多人協(xié)作或一人獨立完成，縮短了手術(shù)時間，并能有效誘導(dǎo)出血管的慢性排斥反應(yīng)。經(jīng)過預(yù)實驗訓(xùn)練，此方法上手快，可復(fù)制性強，符合實驗動物的“3R”原則，可為心臟移植慢性排斥反應(yīng)的病理和治療提供模型。