佘金銘 車 靜 陳聰穎 郭煜暉 崔 蕾

(1.三峽大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 醫(yī)療美容科，湖北 宜昌 443003)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，死亡率居女性癌癥之首，約90%的乳腺癌相關(guān)死因歸結(jié)于轉(zhuǎn)移[1，2]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間充質(zhì)細(xì)胞分化的現(xiàn)象[3]。近期研究表明，腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT伴隨miRNA改變，調(diào)控miRNA可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞EMT[4]。miRNA是一種非編碼小分子RNA，通過與靶mRNA 3'UTR結(jié)合，調(diào)控mRNA的表達(dá)，從而實現(xiàn)對基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[5]。阿霉素可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞EMT[6]，本研究分析了阿霉素誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞EMT前后miRNAs分子的表達(dá)差異，尋找阿霉素誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞EMT中起關(guān)鍵作用的miRNAs分子，并觀察該miRNA對阿霉素耐藥及乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響，為臨床防治腫瘤細(xì)胞EMT提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料

①乳腺癌細(xì)胞系及阿霉素：實驗用乳腺癌細(xì)胞系MCF-7購自武漢大學(xué)乳腺癌細(xì)胞系資料庫；實驗用細(xì)胞系培養(yǎng)于內(nèi)含100 U/mL青霉素、0.1 g/L鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每2 d傳代1次，所有實驗用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。阿霉素購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。②細(xì)胞免疫熒光、Western blot及RT-PCR相關(guān)材料：miRNA155反轉(zhuǎn)錄引物、miRNA200c熒光定量PCR引物及U6引物均由上海生工技術(shù)設(shè)計公司合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、E-cadherin抗體均購自Invitrogen公司。③細(xì)胞轉(zhuǎn)染及細(xì)胞侵襲實驗相關(guān)材料：所有質(zhì)粒均購自ABI公司，LipofectamineTM3000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；Transwell小室與細(xì)胞培養(yǎng)板由康寧公司生產(chǎn)，Matrigel購于BD公司。

通過檢索和收集國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，我們成功篩選部分與EMT相關(guān)的miRNAs分子，設(shè)計miRNA反轉(zhuǎn)錄引物及熒光定量PCR引物并由上海生工合成，序列結(jié)構(gòu)如表1。

表1 引物序列表

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組

MCF-7細(xì)胞分為4組：對照組、阿霉素處理1周組、阿霉素處理2周組和阿霉素處理3周組，阿霉素的處理劑量為10 ng/mL[7]。將細(xì)胞置于37℃、5% CO2孵育箱中連續(xù)培養(yǎng)72 h后，進(jìn)行下述實驗。

1.2.2 Western blot檢測E-cadherin蛋白表達(dá)

提取MCF-7細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白含量，取50 μg含MCF-7細(xì)胞蛋白的溶液并加入等量2×SDS上樣Buffer，100℃變性10 min，SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。加入封閉液封閉膜1 h，加入一抗(E-cadherin和兔多克隆抗體，分別按1∶1 000和1∶2 000稀釋)4℃冰箱孵育過夜。TBST沖洗3次，加入二抗，室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。

1.2.3 免疫熒光檢測E-cadherin蛋白表達(dá)

將10 ng/mL阿霉素處理3周的MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)至12孔板，每組細(xì)胞設(shè)4個復(fù)孔，多聚甲醛固定，0.3% Triton-X透膜，BSA室溫孵育30 min，PBS清洗后控干，一抗4℃孵育過夜，標(biāo)記熒光二抗室溫下孵育2 h。熒光顯微鏡下觀察E-cadherin蛋白的表達(dá)情況。

1.2.4 RT-PCR檢測MCF-7細(xì)胞miRNA155和miRNA200c表達(dá)水平

提取MCF-7細(xì)胞總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：總RNA 1 μL、miRNA-RT Primer 1 μL、M-MLV 0.5 μL、4×dNTP 1 μL、5×RT Buffer 4 μL，補充反應(yīng)體系至20 μL。RT-PCR試劑盒檢測各組細(xì)胞內(nèi)miRNA155、miRNA200c的表達(dá)，PCR反應(yīng)體系：miRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL、2×RT-PCR Buffer 20 μL、miRNA Specific Primer Set 1 μL、Taq酶 0.2 μL，補充反應(yīng)體系至20 μL。以U6作為內(nèi)參檢測細(xì)胞內(nèi)miRNA155及miRNA200c相對表達(dá)量，使用ABI 7500 Fast儀擴(kuò)增并記錄Ct值，miRNA相對表達(dá)量用2-ΔΔCt表示，實驗重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)分析miRNA155轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞前后細(xì)胞的凋亡情況

觀察轉(zhuǎn)染miRNA155 mimics后，阿霉素處理MCF-7細(xì)胞凋亡作用的差異。取正常培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞，將之分為空白對照組和miRNA-155轉(zhuǎn)染組，待細(xì)胞融合度接近80%時按照LipofectamineTM3000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，孵育24 h后刮取收集細(xì)胞，PBS洗2次，并加入70%乙醇4℃固定過夜。離心棄上清，加入Triton X-100及200 μg/mL的RNase A各200 μL，置于37℃恒溫箱內(nèi)15 min，再加入100 μg/mL的PI染料1 mL，室溫避光靜置15 min，行流式細(xì)胞術(shù)檢測，每份樣品檢測5 000個細(xì)胞，分別檢測相應(yīng)的凋亡情況。

1.2.6 細(xì)胞侵襲實驗驗證miRNA155對MCF-7細(xì)胞侵襲能力的影響

取阿霉素處理3周的MCF-7細(xì)胞分為4組，分別為空白對照組、對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空轉(zhuǎn)染組及miRNA155轉(zhuǎn)染組。將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，每個Transwell小室上層均包被matrigel，放入37℃培養(yǎng)箱中孵育5 h，將4組細(xì)胞分別制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/mL。用無血清培養(yǎng)基清洗matrigel 1次，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，下腔室中加入500 μL含血清的培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出Transwell用PBS洗2遍，4%多聚甲醛4℃固定，加入1%結(jié)晶紫染色10 min，將基質(zhì)膠下層置于顯微鏡下觀察，選擇5個高倍鏡視野對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，實驗重復(fù)3次，計算每個視野下細(xì)胞的平均數(shù)，繪制柱狀圖。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 相差顯微鏡結(jié)果

相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，見圖1。對照組MCF-7細(xì)胞光鏡下呈圓形或橢圓形、呈鋪路石樣，細(xì)胞間連接緊密。阿霉素誘導(dǎo)3周后，細(xì)胞形態(tài)呈梭形及不規(guī)則形，類似成纖維細(xì)胞，細(xì)胞間連接松散。

2.2 阿霉素對E-cadherin蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)E-cadherin蛋白表達(dá)，見圖2。與對照組相比，阿霉素不同時間處理組E-cadherin表達(dá)均明顯低于對照組，且隨阿霉素處理時間增加，E-cadherin表達(dá)逐漸降低(均P<0.05)。結(jié)果提示阿霉素可下調(diào)E-cadherin表達(dá)，并隨時間延長作用增強(qiáng)。

2.3 細(xì)胞免疫熒光結(jié)果

圖3中免疫熒光結(jié)果顯示，10 ng/mL阿霉素培養(yǎng)3周后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，由典型上皮逐漸變?yōu)樗笮渭安灰?guī)則形，類似肌成纖維細(xì)胞，與對照組相比，阿霉素組E-cadherin免疫熒光表達(dá)明顯降低。

2.4 RT-PCR檢測阿霉素誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞EMT前后miRNA155表達(dá)水平

RT-PCR檢測MCF-7細(xì)胞內(nèi)miRNA155表達(dá)水平(見圖4)，結(jié)果表明，阿霉素處理3周后miRNA155表達(dá)水平顯著提高，同為EMT相關(guān)的miRNA200c表達(dá)并無明顯改變，提示miRNA155可能參與阿霉素誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞EMT過程。

2.5 miRNA155對阿霉素耐藥性的影響

為評估m(xù)iRNA155對阿霉素耐藥性的影響，我們通過轉(zhuǎn)染miRNA155 mimics，建立miRNA155高表達(dá)瞬轉(zhuǎn)模型，流式細(xì)胞儀檢測乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡。阿霉素(10 ng/mL)處理24 h后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miRNA155 mimics組細(xì)胞存活數(shù)高于對照組(見圖5)。分別刮取收集兩組細(xì)胞，行流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡，結(jié)果表明，miRNA155高表達(dá)組凋亡峰小于對照組，提示miRNA155可能抑制ADM誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。

2.6 miRNA155對MCF-7細(xì)胞侵襲能力的影響

為進(jìn)一步驗證miRNA155對MCF-7細(xì)胞侵襲能力的影響，應(yīng)用Transwell實驗檢測各組MCF-7細(xì)胞生物學(xué)行為情況(見圖6)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA155 mimics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞穿透數(shù)小于空白對照組、對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及空轉(zhuǎn)染組，其侵襲能力顯著降低(均P<0.05)，提示miRNA155可能抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲。

3 討論

乳腺癌作為女性常見惡性腫瘤，嚴(yán)重危害女性身體健康，即便在開展乳腺癌篩查的地區(qū)，乳腺癌發(fā)病率仍僅次于肺癌[8]。乳腺癌是一種具有高度浸潤和轉(zhuǎn)移能力的腫瘤，炎癥因子、缺氧、放療、化療等均可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移[9]。腫瘤轉(zhuǎn)移是一連續(xù)復(fù)雜的動態(tài)生物學(xué)過程，與EMT密切相關(guān)。表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志性表型蛋白E-cadherin表達(dá)下降，腫瘤細(xì)胞間黏附能力下降，并伴隨細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞外基質(zhì)降解及細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路異常等[10，11]。原發(fā)部位腫瘤細(xì)胞經(jīng)EMT后獲得遷移及侵襲能力，而間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化在腫瘤轉(zhuǎn)移的最后一步中起重要作用，即從血管或淋巴管中滲出的腫瘤細(xì)胞恢復(fù)到上皮細(xì)胞狀態(tài)，增殖形成繼發(fā)性腫瘤[12]。

阿霉素作為臨床上首個使用的蒽環(huán)類抗癌藥，對乳腺癌具有良好的治療效果，但化療藥物在有效清除腫瘤細(xì)胞的同時亦可引起腫瘤細(xì)胞惡性程度增加，研究發(fā)現(xiàn)阿霉素在腫瘤治療過程中常引起耐藥和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移而致其療效降低[13]。本研究結(jié)果表明阿霉素在處理劑量為10 ng/mL時，隨作用時間延長，乳腺癌細(xì)胞E-cadherin表達(dá)下降，EMT程度增加，提示EMT參與了阿霉素誘導(dǎo)的耐藥過程。

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，miRNA分子與乳腺癌的形成、浸潤、轉(zhuǎn)移、耐藥密切相關(guān)。miRNA200家族是最早發(fā)現(xiàn)參與腫瘤細(xì)胞EMT調(diào)控的miRNA分子，其低表達(dá)可促進(jìn)EMT[14，15]。由于miRNAs分子的表達(dá)具有組織和時相特異性，同一個miRNA分子在不同組織中所起的作用并不相同，如miRNA200a、miRNA200c在乳腺癌、結(jié)腸癌中低表達(dá)可以促進(jìn)EMT形成，高表達(dá)miRNA200a、miRNA200c可逆轉(zhuǎn)EMT，但在黑色素細(xì)胞瘤中miRNA200a、miRNA200c高表達(dá)可以促進(jìn)EMT[16-18]。本研究結(jié)果提示miRNA200c可能不參與阿霉素誘導(dǎo)的乳腺癌EMT過程。

本研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌EMT過程中miRNA155表達(dá)水平升高，提示miRNA155可能參與乳腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生發(fā)展。體外實驗表明miRNA155上調(diào)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，動物實驗也驗證了miRNA155促進(jìn)腫瘤增殖的作用[19]。通過miRNA155靶基因預(yù)測和實驗驗證，miRNA155可能通過抑制FOXO3a表達(dá)和磷酸化活化，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移[20]。另有研究提示miRNA155通過抑制抑癌基因TP53表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)耐藥產(chǎn)生[21]。在腫瘤免疫調(diào)控方面，miRNA155缺失可導(dǎo)致TH17細(xì)胞分化異常，TH17細(xì)胞是抗原驅(qū)動的記憶T細(xì)胞，參與慢性炎癥誘導(dǎo)惡性腫瘤的轉(zhuǎn)化，在幽門螺桿菌感染胃上皮細(xì)胞的胃癌模型中可觀察到miRNA155高表達(dá)，在胃癌組織中miRNA155亦呈高表達(dá)[22]。通過分析乳腺癌和周圍組織中miRNA155的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)癌組織中miRNA155表達(dá)高于癌旁組織，該結(jié)果提示miRNA155可能為腫瘤演進(jìn)過程中重要的標(biāo)志分子[23]。雖然miRNA155作為oncomiR可促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，然而近年來，在某些腫瘤中，相繼有關(guān)于miRNA155逆轉(zhuǎn)EMT過程、發(fā)揮抑瘤作用的報道。Liu等[24]研究發(fā)現(xiàn)miRNA155能明顯抑制大腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。另有研究表明miRNA155通過調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的成纖維細(xì)胞生長因子-2(fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)的表達(dá)從而抑制食管癌細(xì)胞的增殖，并通過抑制血管形成降低食管癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力[25]。在本實驗中，我們研究過表達(dá)miRNA155對MCF-7細(xì)胞侵襲能力的影響，并以一線化療藥物阿霉素作用于MCF-7細(xì)胞，觀察瞬轉(zhuǎn)miRNA155 mimics與對照組細(xì)胞凋亡的生物學(xué)行為，結(jié)果表明外源轉(zhuǎn)染miRNA155可增加阿霉素的耐藥性、抑制乳腺癌的侵襲能力。究竟是何機(jī)制使miRNA155在不同腫瘤中的作用存在差異還有待于進(jìn)一步研究。

化療藥物阿霉素誘導(dǎo)乳腺癌耐藥過程中，EMT發(fā)揮了重要作用。該過程中miRNA155高表達(dá)提示miRNA155可能是乳腺癌演進(jìn)、耐藥的一個重要標(biāo)志分子，檢測其表達(dá)可作為評估乳腺癌預(yù)后的一個潛在指標(biāo)。此外，miRNA155可能參與了乳腺癌EMT過程，其過表達(dá)可能增加阿霉素的耐藥性，但減弱乳腺癌的侵襲能力。