摘? 要：為選擇雜交后代優(yōu)良株系，對鐵皮石斛（Dendrobium officinale）、霍山石斛（Dendrobium huoshanense）及其雜交F1代株系的組培苗及栽培苗生長量、表型性狀及多糖含量進行測定和分析。結(jié)果表明：各株系的組培生長量差異顯著，變幅為0.15～0.69 g，超親株系占75.00%，移栽生長量變幅為0.03～0.44 g，超親株系占75.00%;組培苗8個表型性狀表現(xiàn)為超親，占總考察性狀的88.89%;栽培苗4個表型性狀表現(xiàn)為超親，占總考察性狀的44.44%，各株系多糖含量與親本差異顯著，7個株系的多糖含量表現(xiàn)為超親，占總考察株系的87.50%?？梢姡描F皮石斛與霍山石斛雜交是改良石斛產(chǎn)量與品質(zhì)的有效途徑之一。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛;霍山石斛;雜交;表型性狀;多糖

中圖分類號：S567? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： To select the best hybrid lines， the growth， phenotypic traits and polysaccharide content of Dendrobium officinale， Dendrobium huoshanense and their F1 hybrid lines were determined and analyzed. The growth of tissue culture was significantly different in each line， in the range 0.15-0.69 g， superior to their parental strains accounting for 75.00%. The growth of the transplanting seedlings was ranged for 0.03-0.44 g， superior to their parental strains， accounting for 75.00%. Eight phenotypic traits of the tissue culture seedlings showed superior to their parents， accounting for 88.89% of the total investigation. In the transplanting seedlings， four phenotypic traits of the cultivated seedlings showed superior to their parents， accounting for 44.44% of the total investigation. The content of polysaccharides in each line was significantly different from that of their parents. The content of polysaccharides in seven lines was superior to their parents， accounting for 87.50% of the total lines studied. In summary， interspecific hybridization is one of the effective ways to improve the output and quality of Dendrobium.

Keywords： Dendrobium officinale; Dendrobium huoshanense; hybridization; phenotypic character; polysaccharide

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.08.010

中藥石斛為石斛屬多種藥用植物的總稱，為我國傳統(tǒng)名貴中藥，具有滋陰清熱、益胃生津、潤肺止咳及清音明目等功效。我國原產(chǎn)石斛屬植物74種和2變種中，作為藥用石斛的就超過40多種[1-2]?；羯绞―endrobium houshanense）因其藥用歷史悠久、品質(zhì)上乘[3-4]，被認(rèn)為是石斛中的極品，但由于本種野生資源稀少、植株矮小、生長緩慢、人工栽培難度大，難以進行大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化推廣[5]，因此對霍山石斛進行改良具有重大的產(chǎn)業(yè)價值。鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是藥用栽培最為廣泛的品種之一，與霍山石斛有較近的親緣關(guān)系[6]，相對霍山石斛，鐵皮石斛具有環(huán)境適應(yīng)性強、生長迅速、生物產(chǎn)量大、規(guī)?；耘喑墒斓葍?yōu)點，但由于產(chǎn)業(yè)規(guī)模擴大過快，品質(zhì)參差不齊，鐵皮石斛單價逐年下跌，因此對鐵皮石斛進行品質(zhì)改良是鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)研究的重點之一[7]。

有性雜交是品種改良的有效途徑之一，雜交親本的遺傳多樣性是有性雜交實施的基礎(chǔ)，利用不同親本進行雜交可以得到較為豐富的F1代分離群體，篩選優(yōu)良種質(zhì)[8]。石斛屬植物為蘭科附生蘭類，普遍存在生長緩慢、對環(huán)境敏感，自然狀態(tài)下種子萌發(fā)率低的特點[9-10]，加上近年來破壞性采集嚴(yán)重，野生石斛資源已較為罕見。特別是霍山石斛，其分布地域窄，僅見于安徽及河南少部分地區(qū)[11]，種群遺傳多樣性指數(shù)處于極低水平[12]，這些特性使得霍山石斛進行種內(nèi)雜交的有效性大大降低。利用種間雜交可使不同物種優(yōu)良特性重組，擴大遺傳變異，從而創(chuàng)造新的種質(zhì)。研究表明石斛屬植物種內(nèi)和種間雜交的親和力均較高，可進行廣泛的雜交[13-18]。此前，本課題組進行了大量的藥用石斛種間雜交試驗[19-20]，獲得了霍山石斛與鐵皮石斛正反交組合的無菌萌發(fā)植株，并利用SSR分子標(biāo)記對霍山石斛和鐵皮石斛正反交后代進行了雜種鑒定[21]，對已鑒定為陽性的真雜種進行了單株組培快繁，形成性狀一致的單株克隆株系。本試驗隨機選取8個株系，對其及親本的組培生長量、栽培生長量、植株表型性狀、品質(zhì)性狀及多糖含量進行測定和分析，以期篩選出優(yōu)于父母本的新種質(zhì)，為藥用石斛屬植物的品種改良提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

以鐵皮石斛為母本，霍山石斛為父本，雜交F1代株系中隨機選取8份（TH29、TH31、TH25、TH9、TH23、TH7、TH32、TH13）以及2個親本，共10份為供試材料，所有材料均保存于三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院藥用植物研究所實驗室及種質(zhì)資源圃。

1.2? 方法

1.2.1? 生長量的測定? 以鐵皮石斛、霍山石斛及其雜交F1代株系的無菌苗為材料，剪成單節(jié)莖段，接種于培養(yǎng)基1/2MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+香蕉泥50 g/L+糖30 g/L+AC 1 g/L中，每種材料接種5瓶，每瓶20個莖段，3個生物學(xué)重復(fù)。接種4個月后統(tǒng)計組培苗的生長量，移栽6個月后統(tǒng)計移栽苗生長量。生長量（g）=處理后的重量處理前的重量。

1.2.2? 組培苗、移栽苗植株形態(tài)分析? 組培苗植株形態(tài)測定：莖段接種4個月后，每份材料隨機選取組培苗10株，對組培苗的株高、葉數(shù)、葉長、葉寬（從下至上第3片葉）、根數(shù)、根長（最長根）、單株鮮重、葉幅、莖粗進行觀測，3個生物學(xué)重復(fù)。

移栽苗植株形態(tài)測定：組培苗移栽6個月后，每份材料隨機選取10株，對移栽苗的株高、葉數(shù)、葉長、葉寬（從下至上第3片葉）、根數(shù)、根長（最長根）、單株鮮重、葉幅、莖粗進行觀測，3個生物學(xué)重復(fù)。

組培苗和移栽苗的部分性狀測定參照《石斛蘭種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)質(zhì)量控制規(guī)范》[22]進行。

統(tǒng)計各性狀的雜種指數(shù)HI（hybrid index）[23]：HI=100×（Hi–Mi1）/（Mi2–Mi1）。其中，Hi為雜交種平均值，Mi1為母本平均值，Mi2為父本平均值。HI介于45與55之間屬中間性狀，HI<45為偏母本性狀，HI >55為偏父本性狀，HI >100或HI<0為超親偏離性狀。

1.2.3? 移栽苗多糖分析? 移栽6個月后，每份材料隨機選取10株，剪取地上部，50 ℃烘干，粉碎，參照2015版《中華人民共和國藥典》[24]測定多糖含量，3個生物學(xué)重復(fù)。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，采用DPS 7.05進行相關(guān)分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 生長量分析

莖段接種4個月后，組培苗移栽6個月后，統(tǒng)計生長量，結(jié)果見表1。從表1可以看出，母本鐵皮石斛的組培生長量為0.19 g，父本霍山石斛的組培生長量為0.15 g，8個株系的組培生長量變幅為0.15～0.69 g，平均生長量為0.43 g，6個株系的生長量高于親本，且HI<0，占75.00%，TH23、TH9與親本差異顯著。

母本鐵皮石斛栽培生長量為0.06 g，父本霍山石斛栽培生長量為0.04 g，各株系的移栽生長量變幅為0.03～0.44 g，平均生長量為0.16 g，6個株系的移栽生長量高于親本，占75.00%，TH7與親本的差異顯著。

2.2? 組培苗表型性狀差異及雜種指數(shù)分析

莖段接種后，節(jié)間萌出新芽，4個月對再生苗（圖1）表型性狀進行測定，計算各株系的雜種指數(shù)，其結(jié)果見表2。

2.2.1? 株高? 8個雜交F1代株系的株高高于親本，與親本差異顯著或極顯著，HI<0，表現(xiàn)為超親。

2.2.2? 葉數(shù)? 6個雜交F1代株系的葉片數(shù)低于親本，TH9與親本差異顯著，2個雜交F1代株系介于兩親本之間。

2.2.3? 葉長? 8個雜交F1代株系高于親本，HI<0，表現(xiàn)為超親，7個株系與親本差異顯著或極顯著。

2.2.4? 葉寬? 8個雜交F1代株系高于親本，HI<0，表現(xiàn)為超親，7個株系與親本差異顯著或極顯著。

2.2.5? 根數(shù)? 7個雜交F1代株系高于親本，HI<0，表現(xiàn)為超親，占87.50 %，2個株系與親本的差異顯著或極顯著。

2.2.6? 根長? 8個雜交F1代株系高于親本，HI<0，表現(xiàn)為超親，2個株系與親本差異顯著。

2.2.7? 鮮重? 6個雜交F1代株系高于親本，5個株系的HI<0，表現(xiàn)為超親，占62.50%。

2.2.8? 冠幅? 8個雜交F1代株系高于親本，HI>100，表現(xiàn)為超親，5個株系與親本差異顯著或極顯著。

2.2.9? 莖粗? 4個雜交F1代株系高于親本，HI<0，表現(xiàn)為超親，占50.00%。

從雜種指數(shù)平均值看，9個表型性狀中，8個表型性狀株高、葉數(shù)、葉長、葉寬、根數(shù)、根長、鮮重和冠幅的HI>100或HI<0，為超親偏離性狀，占88.89%。

2.3? 組培苗表型性狀相關(guān)分析

F1代及親本組培苗表型性狀相關(guān)分析結(jié)果見表3。可見，株高與葉長、葉寬、冠幅、根長、鮮重呈極顯著或顯著正相關(guān);葉片數(shù)與葉長呈極顯著負(fù)相關(guān);葉長與葉寬、冠幅、根長呈極顯著或顯著正相關(guān);葉寬與根長、鮮重、冠幅呈極顯著或顯著正相關(guān);根數(shù)與鮮重呈顯著正相關(guān);鮮重與株高、葉寬、根數(shù)、莖粗呈顯著正相關(guān);冠幅與株高、葉長、葉寬呈極顯著或顯著正相關(guān)。

2.4? 移栽苗植株表型性狀及雜種指數(shù)分析

組培苗移栽6個月后（圖2），各株系及親本表型性狀測定及雜種指數(shù)分析結(jié)果見表4。

2.4.1? 株高? 2個雜交F1代株系高于親本，HI<0，表現(xiàn)為超親，占25.00%。

2.4.2? 葉數(shù)? TH32高于親本，HI<0，表現(xiàn)為超親，占12.50%。

2.4.3? 葉長? 8個雜交F1代株系高于親本，HI<0，表現(xiàn)為超親。

2.4.4? 葉寬? 8個雜交F1代株系高于親本，HI<0，表現(xiàn)為超親，TH23與親本差異顯著。

2.4.5? 根數(shù)? TH25高于親本，HI<0，表現(xiàn)為超親，占12.50%。

2.4.6? 根長? 8個雜交F1代株系高于親本，HI<0，表現(xiàn)為超親，TH25、TH7與親本的差異顯著。

2.4.7? 鮮重? 6個雜交F1代株系高于親本，HI<0，表現(xiàn)為超親，占75.00%。

2.4.8? 冠幅? 8個雜交F1代株系高于親本，HI<0，表現(xiàn)為超親。

2.4.9? 莖粗? 4個雜交F1代株系高于親本，HI<0，表現(xiàn)為超親，占50.00%。

從雜種指數(shù)平均值看，9個表型性狀中葉長、根長、鮮重、冠幅4個性狀的HI<0，表現(xiàn)為超親，占44.44%。

2.5? 移栽苗多糖含量分析

本研究對移栽6個月的雜交F1代株系及親本的多糖含量進行測定，結(jié)果見表5。從表5可以看出，雜交F1代7個株系多糖含量高于親本，方差分析結(jié)果表明，7個株系與親本的差異顯著或極顯著。從雜種指數(shù)看，7個株系多糖含量的HI<0，表現(xiàn)為超親，占87.5%。

2.6? 移栽苗性狀相關(guān)分析

F1代及親本移栽苗9個表型性狀及品質(zhì)性狀多糖含量的相關(guān)分析結(jié)果見表6。從表6可以看出，株高與葉長、葉寬、鮮重、冠幅、莖粗、葉片數(shù)呈顯著或極顯著正相關(guān);鮮重與株高、葉長、葉寬、根長、冠幅、莖粗呈顯著或極顯著正相關(guān);多糖含量與其他表型性狀相關(guān)程度低。

3? 討論

霍山石斛植株矮小，生長緩慢，如何提高其生長量是其重要育種目標(biāo)之一。雖然利用傳統(tǒng)雜交優(yōu)勢改良藥用植物品種在藥理藥效和實證性等方面還有待驗證，但利用雜種優(yōu)勢改良品種將是培育藥用石斛種質(zhì)的新趨勢。蔡永萍等[25]利用霍山石斛與銅皮石斛進行雜交，發(fā)現(xiàn)其F1代生長量介于兩親本之間，高于母本霍山石斛，接近父本銅皮石斛。本研究對鐵皮石斛、霍山石斛及其雜交F1代株系的組培苗及栽培苗生長量測定表明，各株系的組培生長量差異顯著，最大生長量是母本鐵皮石斛的3.63倍，父本霍山石斛的4.60倍，移栽6個月后各株系最大生長量是母本鐵皮石斛的7.33倍，父本霍山石斛的11.00倍。鐵皮石斛、霍山石斛雜交F1代生長量無論在組培還是栽培階段均表現(xiàn)明顯的超親優(yōu)勢。而在組培階段考察的9個表型性狀中，8個性狀表現(xiàn)為超親，占總數(shù)的88.89%;在栽培苗階段4個表型性狀表現(xiàn)為超親，占總數(shù)的44.44%。相對霍山石斛與銅皮石斛F1代[25]，鐵皮石斛與霍山石斛的雜交后代在生長量方面表現(xiàn)更為顯著的雜種優(yōu)勢。

多糖是石斛屬植物的主要活性成分，具有較高的藥用價值，是評價石斛品質(zhì)的重要指標(biāo)。王濤等[13]對鐵皮石斛、重唇石斛及其F1代石斛堿、石斛多糖含量進行測定發(fā)現(xiàn)，雜交F1代有3.00%的單株多糖含量超過兩親本，7.00%的單株多糖含量低于兩親本，90.00%的單株多糖含量介于雙親之間。汪曙等[14， 16]、蔡永萍等[25]對霍山石斛、銅皮石斛雜交種與其親本多糖含量變化規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，1年莖多糖含量雜交石斛高于兩親本，2～3年莖多糖含量低于兩親本。本研究對鐵皮石斛、霍山石斛及其雜交F1代移栽6個月后的株系多糖含量進行了比較，發(fā)現(xiàn)各株系多糖含量差異顯著，雜交F1代多糖最高含量分別是母本鐵皮石斛的1.96倍，父本霍山石斛的3.24倍，雜交F1代考察的8個株系中，7個株系的多糖含量表現(xiàn)超親，占87.50%，僅1個株系介于兩親本之間，占12.50%，同霍山石斛與銅皮石斛雜交后代1年莖表現(xiàn)相似，但優(yōu)于2～3年莖[14， 16， 25]及鐵皮石斛與重唇石斛雜交F1代[13]。

與此前石斛種間雜交不同的是[13-14， 16， 25]，本研究是在SSR分子標(biāo)記篩選石斛種間雜交后代陽性真雜種的基礎(chǔ)上[21]，利用組織培養(yǎng)技術(shù)培育性狀一致的單株克隆株系進行的一系列分析。結(jié)果表明，無論在含量還是產(chǎn)量方面，石斛種間雜交后代均存在較大的雜種優(yōu)勢。合理利用石斛種間雜種優(yōu)勢，將有效推動藥用石斛產(chǎn)量與品質(zhì)的發(fā)展。

參考文獻(xiàn)

沙文蘭， 羅金裕. 中藥石斛鑒定研究——Ⅰ. 石斛原植物和藥材調(diào)查[J]. 藥學(xué)學(xué)報， 1980， 15（6）： 351-358， 386.

李滿飛， 徐國鈞， 平田義正， 等. 中藥石斛類多糖的含量測定[J]. 中草藥， 1990， 21（10）： 10-12， 46.

吳慶生， 楊道麒， 徐? 云， 等. 中藥霍山石斛的微量元素分析及TE圖譜鑒定[J]. 微量元素與健康研究， 1995， 12（1）： 31-32.

李秀芳. 霍山石斛和四種藥典石斛多糖降血糖活性比較研究[D]. 合肥： 合肥工業(yè)大學(xué)， 2012.

吳胡琦， 羅建平. 霍山石斛的研究進展[J]. 時珍國醫(yī)國藥， 2010， 21（1）： 208-211.

Luo J， Hou B W， Niu Z T， et al. Comparative chloroplast genomes of photosynthetic orchids： insights into evolution of the Orchidaceae and development of molecular markers for phylogenetic applications[J]. PLoS One， 2014， 9（6）： e99016.

何伯偉， 潘慧鋒. 浙江鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)提升發(fā)展的實施措施與建議[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014（2）： 152-155.

朱? 波， 榮? 松， 吳令上， 等. 鐵皮石斛優(yōu)良親本雜交F1代苗期選擇[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志， 2016， 22（5）： 25-29.

王立安， 沈淑瑜， 李煜照， 等. 鐵皮石斛種子試管苗的大量繁殖[J]. 安徽大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 1989（1）： 83-86.

于力文， 徐云昌鳥 . 霍山石斛種子試管繁殖的研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)院學(xué)報， 1987， 14（1）： 1-9， 73.

中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會. 中國植物志： 第19卷[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 1999： 117.

張瀟瀟. 霍山石斛的分子鑒定及其遺傳多樣性評價[D]. 南京： 南京師范大學(xué)， 2012.

王? 濤， 應(yīng)奇才， 徐祥彬， 等. 鐵皮石斛和重唇石斛雜交F1代總生物堿和多糖含量測定[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010（6）： 1377-1380.

汪? 曙， 魏鳳娟， 蔡永萍， 等. 霍山石斛雜交種與親本有效成分積累規(guī)律的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010， 38（7）： 3468-3469， 3520.

潘春香， 白? 音， 包英華， 等. 藥用石斛種間有性雜交育種階段性初報[J]. 時珍國醫(yī)國藥， 2010， 21（5）： 1214-1215.

汪? 曙， 林? 毅， 蔡永萍， 等. 霍山石斛雜交種與其親本生長生理指標(biāo)及藥效成分含量的比較[J]. 中國中藥雜志， 2006， 31（17）： 1401-1404.

Inthawong S， Bundithya W， Kuanprasert N， et al. Analysis of intersectional hybrids of Dendrobium by RAPD technique[J]. Kasetsart J （Nat Sci）， 2006， 40（2）： 456 - 461

Spence P， Viravaidya M. The species and hybrids of Dendrobium section latouria[M]//Proceedings of the Fourth Asia Pacific Orchid Conference Chiang Mai， Thailand. 1992.

李永清， 葉? 煒， 江金蘭， 等. 石斛蘭人工授粉結(jié)實性研究[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2015， 30（8）： 779-783.

李永清， 葉? 煒， 江金蘭， 等. 藥用石斛種質(zhì)資源生物學(xué)特性觀察[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 43（12）： 39-40， 50.

李永清， 江金蘭， 葉? 煒， 等. SSR分子標(biāo)記鑒定鐵皮石斛與霍山石斛的正反交后代[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2017， 32（8）： 870-873.

尹俊梅， 任? 羽， 楊光穗， 等. 種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)質(zhì)量控制規(guī)范[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2008： 92-119

田永勝， 段會敏， 唐? 江， 等. 石斑魚雜交種“云龍斑”與親本的表型數(shù)量性狀判別分析[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報， 2017， 26（6）： 808-817

國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典： 一部[M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2015： 282-283.

蔡永萍， 汪? 曙， 林? 毅， 等. 霍山石斛F1代生長、有效成分和生理特性的研究[J]. 中國中藥雜志， 2005， 30（14）： 1064-1068.