趙永慧 楊杰 朱卿正 郭長明 柴金龍 王淑軍 房耀維 盤賽昆

摘要?[目的]從發(fā)酵酸魚中篩選鑒定得到一株產(chǎn)植物乳桿菌素的植物乳桿菌MMB-03，通過研究植物乳桿菌素的酸、溫度穩(wěn)定性及抑菌效果，確定了該植物乳桿菌素的抑菌特性。[方法]采用形態(tài)學、生理生化、16S rDNA 分析鑒定該菌株為植物乳桿菌。采用打孔法測定植物乳桿菌素的抑菌效果。[結(jié)果]該植物乳桿菌素在pH 4.0～7.0時均有較強的抑菌活性;121 ℃ 處理20 min仍有良好的抑菌活性;對指示菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌等均有良好的抑菌效果。[結(jié)論]植物乳桿菌MMB-03在水產(chǎn)飼料和食品保藏方面具有良好的應用前景。

關(guān)鍵詞?植物乳桿菌;鑒定;細菌素;理化性質(zhì);抑菌

中圖分類號?TS?201.3文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2020）17-0189-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.17.049

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Screening Identification and Bacteriostasis Characteristics of Lactobacillus plantarum MMB?03

ZHAO Yong?hui， YANG Jie， ZHU Qing?zheng et al

（Jiangsu Ocean University， Lianyungang， Jiangsu 222061）

Abstract?[Objective] A strain of Lactobacillus plantarum MMB?03 was obtained from fermented acid fish. The antibacterial properties of plantaricin from Lactobacillus plantarum MMB?03 were determined by researching acid stability， temperature stablility， and bacteriostatic activity. [Method] The strain was identified as Lactobacillus plantarum by morphology， hysiological and biochemical and 16S rDNA. The bacteriostatic effect of plantaricin was determined by punching. [Result] The plantaricin had strong bacteriostatic activity at pH 4.0-7.0， and had good bacteriostatic activity at 121℃ for 20 min. It also had good bacteriostatic effect on indicator bacteria Staphylococcus aureus， Escherichia coli and Bacillus cereus. [Conclusion] Lactobacillus plantarum MMB?03 has a good application prospect in aquatic feed and food preservation.

Key words?Lactobacillus plantarum;Appraisal;Bacteriocins;Physical and chemical properties;Bacteriostatic

乳酸菌在自然界中廣泛存在，是“公認安全”的微生物，其產(chǎn)物已被允許添加到食品工業(yè)中[1-2]。細菌素是由核糖體合成的具有抑菌作用的一類蛋白類物質(zhì)[3]，已被廣泛應用在食品工業(yè)、動物生產(chǎn)和醫(yī)療以及畜禽飼料等領(lǐng)域[4-5] 。乳酸菌生成的細菌素能夠有效抑制食品中的腐敗菌，延長食品貨架期，可被用作生物保鮮劑[6-7]，如乳酸鏈球菌素（Nisin）已在食品中大量應用[8-9]。

植物乳桿菌是乳酸菌的一種，常見于肉類、奶類及蔬菜的發(fā)酵制品中，是人體胃腸道的益生菌群，具有增強機體免疫力、降低膽固醇、預防心血管疾病和促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收等多種功能[10]。植物乳桿菌來源的細菌素被稱為植物乳桿菌素，植物乳桿菌素屬于I類或II類細菌素，分子量較小、熱穩(wěn)定性高，可被蛋白酶降解[11]。目前，研究較為深入的植物乳桿菌素有Plantaricin C、Plantaricin EF、Plantaricin JK[12]。有研究者從傳統(tǒng)泡菜、果蔬醬、畜禽腸道[13]中篩選得到植物乳桿菌產(chǎn)生的植物乳桿菌素具有良好的抑菌活性。但目前報道的植物乳桿菌素抑菌譜較窄，限制了其在食品工業(yè)中的大規(guī)模應用。因此，篩選出產(chǎn)廣譜抑菌性植物乳桿菌素的植物乳桿菌，對于開發(fā)新的防腐抑菌劑具有重要意義。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?樣品。

供試植物乳桿菌采自實驗室自制發(fā)酵酸魚。

1.1.2?指示菌。

大腸桿菌（CICC 10003）、金黃色葡萄球菌（CICC 23656）、蠟樣芽孢桿菌（CICC 23828）、維氏氣單孢菌、嗜水氣單孢菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血性弧菌均來自實驗室保藏。

1.1.3?培養(yǎng)基和試劑。

MRS培養(yǎng)基：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸氫銨2 g，七水硫酸鎂0.58 g，一水硫酸錳0.19 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，蒸餾水1 L，pH 6.2～6.4，115 ℃、20 min滅菌備用，固體培養(yǎng)基另加1.5%～2.0%的瓊脂。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 L，pH 7.0，121 ℃、20 min滅菌備用，固體培養(yǎng)基另加1.5%～2.0%的瓊脂。

革蘭氏染色試劑盒，杭州百思生物科技有限公司;細菌基因組提取試劑盒，美國Omega公司;過氧化氫酶，美國Sigma公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4?儀器與設備。

Spx-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;高速冷凍離心機，美國賽默飛世爾科技有限公司;Mastercycler nexus聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀，德國Eppendorf有限公司。

1.2?方法

1.2.1?樣品的采集。

用無菌勺子舀取少量酸魚酸湯，轉(zhuǎn)接至100 mL 已滅菌三角瓶中，標記編號。

1.2.2?乳酸菌MMB-03的分離。

取1 mL樣品濾液接種到100 mL MRS培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h。取1 mL 富集后的樣液梯度稀釋至10-6，分別選擇10-4、10-5、10-6濃度的稀釋液100 μL涂布于含0.3%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。挑選具有鈣溶圈的菌株于MRS固體培養(yǎng)基重復劃線分離，得到單菌落后甘油管保藏菌種。

挑取上述分離的純種菌株接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液以8 000 r/min離心15 min 后取上清。以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌為指示菌，采用打孔法對分離得到的菌株上清液進行產(chǎn)乳酸菌素的篩選[14]。

1.2.3?乳酸菌MMB-03菌種鑒定。

1.2.3.1?乳酸菌MMB-03的生理生化鑒定。

根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》對菌株MMB-03進行形態(tài)觀察和生理生化鑒定[15]。

1.2.3.2?16S rRNA的擴增與序列分析。

用細菌基因組快速提取試劑盒提取MMB-03的基因組，進行16S rRNA擴增。PCR擴增引物選擇細菌通用引物，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。反應體系為50 μL：dd H2O 38.0 μL，10×buffer 5.0 μL，Mg2+1.0 μL，dNTP 2.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板1.0 μL，DNA聚合酶0.5 μL。反應程序：94 ℃ 預變性5 min;94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán);72 ℃終延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物測序，所得序列提交Gen Bank。將該序列與Gen Bank 數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，用MEGA 7.0軟件進行16S rRNA序列的比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4?抑菌物質(zhì)的確定。

將菌株以1% 的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，8 000 r/min離心15 min 后取上清液。上清液體積濃縮1倍后，調(diào)節(jié)不同pH以排除有機酸的抑菌影響;選用過氧化氫酶處理以排除過氧化氫對抑菌效果的影響;胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后采用打孔法確認抑菌活性，對照選擇同樣處理的MRS液體培養(yǎng)基，確定發(fā)酵產(chǎn)物中的抑菌物質(zhì)。

1.2.5?植物乳桿菌素的熱穩(wěn)定性。

將植物乳桿菌MMB-03的發(fā)酵上清液，分別在4、25、50和100 ℃處理30 min，121 ℃下處理20 min（使用滅菌鍋處理），對照選擇沒有處理的發(fā)酵上清液。處理完成后立即進行抑菌試驗。

1.2.6?植物乳桿菌素的酸穩(wěn)定性。

用3 mol/L NaOH 溶液將植物乳桿菌MMB-03的發(fā)酵上清液pH調(diào)節(jié)至4.0、5.0、6.0和7.0，并保持30 min，處理結(jié)束后采用打孔法測試抑菌活性。

1.2.7?植物乳桿菌素的抑菌活性驗證。

分別以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、維氏氣單孢菌、嗜水氣單孢菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血性弧菌為指示菌做抑菌試驗，驗證該植物乳桿菌素對食品中常見革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的抑菌效果。

2?結(jié)果與分析

2.1?菌株的篩選

分別以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌為指示菌，采用打孔法對從實驗室自制發(fā)酵酸魚中分離得到3株菌的抑菌圈直徑進行測定，結(jié)果分別為（1000±0.28）、（13.25±0.07）、（10.34±0.37） mm，說明它們均有良好的抑菌效果，挑選其中抑菌性最強的一株作為繼續(xù)研究的對象，并將該菌株命名為MMB-03。

2.1.1?植物乳桿菌的鑒定。

菌株MMB-03的形態(tài)學觀察結(jié)果見圖1。菌株MMB-03為革蘭氏陽性菌，菌體短桿狀，無鞭毛和芽孢。菌株MMB-03在MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，菌落邊緣整齊無鋸齒狀，呈乳白色，表面光滑不透明。

菌株MMB-03的部分生理生化特征結(jié)果見表1。由表1可知，菌株MMB-03不能使明膠液化、發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣、接觸酶試驗呈陰性，能夠利用發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、果糖、蔗糖、乳糖，但不能利用木糖和阿拉伯糖。

2.1.2?16S測序結(jié)果。

利用16S rRNA進行PCR擴增測序，將所得序列與Gen Bank數(shù)據(jù)庫中的序列進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)與菌株MMB-03相似度較高的菌株均為植物乳桿菌，且相似性達到100%（圖2）。因此，將菌株MMB-03鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

2.2?抑菌物質(zhì)的確定

2.2.1?排酸試驗結(jié)果。

調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH分別為4.0和4.5，對照選擇使用乳酸調(diào)節(jié)至相同pH的MRS液體培養(yǎng)基，抑菌試驗驗證結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至4.0，抑菌活性無明顯下降，對照抑菌活性顯著下降;調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至4.5，抑菌活性減弱，對照已無抑菌性。說明發(fā)酵上清液中含有除乳酸以外的抑菌物質(zhì)。

2.2.2?排過氧化氫試驗結(jié)果。

乳酸菌發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生的過氧化氫同樣具有抑菌作用，過氧化氫酶充分酶解發(fā)酵上清液，結(jié)果原發(fā)酵液、酶處理、對照的抑菌圈直徑分別為（1202±0.06）、（11.35±0.04）、0 mm，發(fā)酵液經(jīng)過氧化氫酶處理后，與原發(fā)酵液相比，抑菌性無顯著性下降，同樣處理的MRS培養(yǎng)基對照組則無抑菌性，說明發(fā)酵液中抑菌作用不是過氧化氫產(chǎn)生的。

2.2.3?蛋白酶分解試驗結(jié)果。

分別使用胃蛋白酶和胰蛋白酶處理發(fā)酵液，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，經(jīng)蛋白酶處理后，發(fā)酵液抑菌性顯著下降，說明菌株MMB-03產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可以被蛋白酶部分分解。排除酸和過氧化氫對抑菌效果的影響后，蛋白酶分解上清液，抑菌效果下降，說明發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)細菌素。

2.3?植物乳桿菌素的熱穩(wěn)定性

將植物乳桿菌MMB-03的發(fā)酵上清液在不同溫度下處理一定時間，其抑菌結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，不同溫度處理后，其抑菌性無顯著性差異。121 ℃處理20 min后，與對照相比，抑菌性無明顯下降。說明該植物乳桿菌素的熱穩(wěn)定性較好，一般的熱加工對其抑菌性影響不大。

2.4?植物乳桿菌素的酸穩(wěn)定性

由圖6可知，隨著pH的逐漸升高，菌株MMB-03發(fā)酵上清液的抑菌性逐漸下降，在pH中性條件下，菌株MMB-03發(fā)酵上清液仍有良好的抑菌性，說明菌株MMB-03發(fā)酵上清液具有良好的酸穩(wěn)定性。

2.5?抑菌活性驗證

以食品中常見的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌為指示菌進行抑菌試驗，研究MMB-03的抑菌活性，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，MMB-03的發(fā)酵產(chǎn)物對食品中常見的革蘭氏陽性、陰性菌具有良好的抑菌效果。

3?討論

生物防腐劑替代化學防腐劑成為食品防腐研究的趨勢。細菌素Nisin等雖然已經(jīng)被大量應用到食品中，但Nisin抗菌譜較窄，僅對革蘭氏陽性菌有很好的抑制效果;納他霉素則能夠有效抑制和殺死酵母菌和霉菌[16]。楊煌建等[17]從鏈霉菌FIM-0916的代謝產(chǎn)物中分離得到具有抗菌活性的環(huán)脂肽化合物0916A，其對革蘭氏陽性菌具有很好的抑制作用。因此，開發(fā)研究具有廣譜抑菌效果的生物源防腐劑具有重要意義。

目前，發(fā)酵食品已經(jīng)成為篩選植物乳桿菌的重要來源[18-19]，也有研究者從雞鴨糞便[20-21]、畜禽腸道[13]中篩選到植物乳桿菌。該研究是從自制可食用酸魚中篩選出植物乳桿菌，菌株來源安全衛(wèi)生。目前發(fā)現(xiàn)的植物乳桿菌素抑菌譜較窄，應用局限性大。葛菁萍等[22]從酸菜中分離得到一株植物乳桿菌產(chǎn)細菌素paracin，其僅能夠抑制沙門氏菌、大腸桿菌等病原菌。plantaricin 35d[23]和ST28MS[24]對大腸桿菌沒有抑制作用。Bac TN365對革蘭氏陰性菌和霉菌有抑菌效果[25]。該研究發(fā)現(xiàn)的植物乳桿菌素可以有效抑制食品中常見的革蘭氏陽性、陰性菌，抑菌范圍更廣。高鵬[14]研究的細菌素雖然有廣譜的抑菌作用，但其在90 ℃ 處理10 min后，細菌素的抑菌性急劇下降;處理30 min后細菌素已無抑菌性。而該研究發(fā)現(xiàn)的植物乳桿菌素在121 ℃處理20 min后抑菌性沒有顯著變化，具有良好的熱穩(wěn)定性。

4?結(jié)論

該研究從實驗室自制酸魚中篩選得到1株具有較強抑菌活性的菌株，通過對該菌株進行生理生化鑒定和分子生物學鑒定，確認該菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），根據(jù)其編號命名為Lactobacillus plantarum MMB-03，并確定了Lactobacillus plantarum MMB-03的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。通過排除有機酸、過氧化氫，并且經(jīng)過胰蛋白酶、胃蛋白酶處理后，確定Lactobacillus plantarum MMB-03可產(chǎn)細菌素。分析表明，該植物乳桿菌素具有良好的熱穩(wěn)定性，抑菌性受酸影響小，能夠有效抑制食品中常見的革蘭氏陽性、陰性菌。該研究為開發(fā)新型天然防腐劑奠定了理論基礎。

參考文獻

[1] KNIG H，F(xiàn)RHLICH J.Lactic acid bacteria.Biology of microorganisms on grapes，in must and in wine[M].Heidelberg：Springer，2009：3-29.

[2] FRANKOS V H，SCHMITT D F，HAWS L C，et al.Generally recognized as safe（GRAS）evaluation of 4?hexylresorcinol for use as a processing aid for prevention of melanosis in shrimp[J].Regulatory toxicology & pharmacology，1991，14（2）：202-212.

[3] 朱雙，張愛忠，姜寧，等.細菌素及其在動物生產(chǎn)中的應用[J].動物營養(yǎng)學報，2014，26（2）：327-333.

[4] DAVIDSON B E.Bacteriocin piscicolin 126：US6054163[P].2000-04-25.

[5] REA M C，SIT C S，CLAYTON E，et al.Thuricin CD，a posttranslationally modified bacteriocin with a narrow spectrum of activity against Clostridium difficile[J].Proceedings of the national academy of sciences，2010，107（20）：9352-9357.

[6] 方士元，謝晶.乳酸菌及其細菌素在海水魚保鮮中應用的研究進展[J].微生物學雜志，2019，39（2）：111-116.

[7] 陳凱，朱璐丹，譚宏亮，等.2株乳酸菌抑菌作用研究及安全性評價[J].南方水產(chǎn)科學，2019，15（5）：118-125.

[8] BAHRAMI A，DELSHADI R，JAFARI S M，et al.Nanoencapsulated nisin：An engineered natural antimicrobial system for the food industry[J].Trends in food science & technology，2019，94：20-31.

[9] 雷濤.生物防腐劑在食品加工中的應用[J].食品安全導刊，2017（36）：44.

[10] 曹承旭，郭晶晶，烏日娜，等.植物乳桿菌的生理功能和組學研究進展[J].乳業(yè)科學與技術(shù)，2018，41（1）：33-39.

[11] 陳一然，張明.植物乳桿菌細菌素的研究與應用[J].中國微生態(tài)學雜志，2011，23（9）：853-856.

[12] ANDERSSEN E L，DIEP D B，NES I F，et al.Antagonistic activity of Lactobacillus plantarum C11：Two new two?peptide bacteriocins，plantaricin EF and JK，and the induction factor plantaricin A[J].Applied & environmental microbiology，1998，64（6）：2269-2272.

[13] 劉韶娜，張斌，相德才，等.一株植物乳桿菌的分離、鑒定及其特性研究[J].飼料研究，2019，42（9）：73-77.

[14] 高鵬.廣譜抗菌乳酸菌的分離鑒定及細菌素的提取、純化及結(jié)構(gòu)鑒定[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2016.

[15] 布坎南R E，吉本斯N E.伯杰細菌鑒定手冊[M].8版.北京：科學出版社，1984：477-478.

[16] 馮林慧，李迎秋.納他霉素和乳酸鏈球菌素復配在食品中的應用[J].中國調(diào)味品，2019，44（2）：190-192.

[17] 楊煌建，張祝蘭，黃小珍，等.FIM-0916菌株中代謝產(chǎn)物的抗菌活性及穩(wěn)定性考察[J].海峽藥學，2014，26（3）：151-155.

[18] 郝永偉.植物乳桿菌的篩選、鑒定及制備工藝研究[D].濟南：齊魯工業(yè)大學，2014.

[19] O′SULLIVAN L，ROSS R P，HILL C.Potential of bacteriocin?producing lactic acid bacteria for improvements in food safety and quality[J].Biochimie，2002，84（5）：593-604.

[20] 張飛燕，張根偉，劉倩倩，等.一株雞源性植物乳桿菌的分離鑒定及特性研究[J].飼料研究，2016（10）：5-8.

[21] 劉芳丹.一株鴨源植物乳桿菌的分離鑒定及其對肉鴨生產(chǎn)性能和免疫機能的影響[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2015.

[22] 葛菁萍，鄒鵬，宋剛，等.酸菜發(fā)酵液中乳酸菌的分離與鑒定[J].食品工業(yè)科技，2007，28（10）：83-84.

[23] MESSI P， BONDI M，SABIA C，et al.Detection and preliminary characterization of a bacteriocin（plantaricin 35d）produced by a Lactobacillus plantarum strain[J].International journal of food microbiology，2001，64（1/2）：193-198.

[24] TODOROV S D，DICKS L M T.Lactobacillus plantarum isolated from molasses produces bacteriocins active against Gram?negative bacteria[J].Enzyme and microbial technology，2005，36（2/3）：318-326.

[25] SMAOUI S，ELLEUCH L，BEJAR W，et al.Inhibition of fungi and gram?negative bacteria by bacteriocin BacTN635 produced by Lactobacillus plantarum sp.TN635[J].Applied biochemistry & biotechnology，2010，162（4）：1132-1146.