朱明明, 楊敏, 劉文玲, 冀林華, 格日力, 李占全△, 崔森△

1青海大學(xué)附屬醫(yī)院血液科(青海西寧 810001)； 2青海高原醫(yī)學(xué)研究中心(青海西寧 810001)

低氧是高原地區(qū)最主要的影響因素，對(duì)機(jī)體包括對(duì)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等造成多方面的影響，同時(shí)伴隨多系統(tǒng)微血管的增生和損傷[1-3]。以往研究表明慢性高原病機(jī)體組織發(fā)生微血管增生[4]。因此，我們推測(cè)，在慢性間歇低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)時(shí)，機(jī)體極有可能發(fā)生微血管增生，由于其病理機(jī)制的復(fù)雜性，至今尚未完全闡明。近年來(lái)，大量研究指出在多種缺血缺氧性疾病中，如腦梗死、腦卒中、病毒感染、急性肺損傷等，基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)高表達(dá)與微血管增生密切相關(guān)。MMP-9能夠特異地水解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的化學(xué)成分Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原和粘連蛋白等，在正常生理情況下，能夠切斷細(xì)胞外基質(zhì)成分，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏著、直接或間接參與胚胎發(fā)育、組織重塑、創(chuàng)傷愈合和血管增生等生理學(xué)過(guò)程，與多種系統(tǒng)疾病相關(guān)，例如腦出血、腦缺氧、腦缺血和缺血再灌注，甚至在新生兒缺氧缺血性腦損傷時(shí)表達(dá)亦有所增加[5-14]，但目前在慢性間歇低氧誘導(dǎo)微血管增生的研究甚少，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。為此，2018年12月至2019年6月，我們建立慢性間歇低氧大鼠模型，探討骨髓組織中MMP-9的表達(dá)水平變化，觀察病理組織中微血管的增生，為進(jìn)一步闡明慢性間歇低壓低氧微血管改變機(jī)制積累資料，并為拓寬相關(guān)疾病治療研究思路提供線索。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 選取36只SPF 級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)健康大鼠(鼠齡：7周左右，體重200～210 g)，分組為：常氧組(n=9)、缺氧7d組(n=9)組、缺氧14d組(n=9)、缺氧28d組(n=9)。由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，大鼠被飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)的鼠籠中，自由進(jìn)水進(jìn)食。制備缺氧組大鼠模型：將缺氧7d組、缺氧14d組、缺氧28d組大鼠在低壓氧艙(青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)中心)內(nèi)飼養(yǎng)，模擬條件：模擬海拔高度5 000 m，氧分壓11.3～11.4 kPa，溫度26～28℃，濕度38%～56%，8 h/d，其余時(shí)間在正常情況下飼養(yǎng)，同一時(shí)間點(diǎn)分別連續(xù)處理 7、14、28 d，制作缺氧組模型。

常氧組大鼠飼養(yǎng)于高原醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物房?jī)?nèi)，模擬條件：海拔2 261 m，溫度20～25℃，通風(fēng)良好，定期消毒。

1.2 主要試劑 Anti-MMP-9 (antibody catalog # ab38898)，提取RNA試劑盒QIAGEN miRNeasy Mini Kit (catalog # 217004)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒Takara PrimeScript RT reagent kit(catalog #RR036A),定量試劑盒Takara TB Green Premix Ex Taq (catalog #RR820A),MMP-9和GAPDH引物(南京金斯瑞公司)，免疫組化試劑盒(中杉金橋)，獸用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)。

1.3 主要方法

1.3.1 測(cè)靜脈血血常規(guī) 給予2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，抽取腹主靜脈血5 mL，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 RT-PCR 測(cè)定MMP-9 mRNA 表達(dá)水平 麻醉大鼠，取分離、剪斷股骨，用1×PBS沖洗骨髓組織于15 mL離心管中，4℃ 離心(3 000 r/min)5 min，300目濾網(wǎng)過(guò)濾，重復(fù)3次，留取沉淀，保存于-80℃冰箱中。吸柱法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量，具體操作按照試劑盒詳細(xì)說(shuō)明進(jìn)行。MMP-9引物序列為(forward:5′-GCATCTGTATGGTCGTGGCT-3′；reverse:5′-TGCAGTGGGACACATAGTGG-3′)，GAPDH(forward:5′-AGTGCCAGCCTCGTCTCATA-3′，reverse:5′-GAACTTGCCGTGGGTAGAGT-3′).

1.3.3 免疫組化觀察微血管密度(MVD) 麻醉大鼠，取分離、剪斷股骨置于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)過(guò)脫鈣、脫水、浸蠟、包埋，切片(厚度5 μm)。(1)抗原修復(fù)：切片放于枸櫞酸緩沖液，微波爐高溫加熱修復(fù)，待自然冷卻后，雙蒸水沖洗2次，7 min/次。(2)阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：3%H2O2的 PBS 溶液室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，6 min/次。(3)血清封閉，室溫孵育1 h。(4)滴加MMP-9抗體，1∶600；室溫孵育30 min，4℃過(guò)夜，沖洗3次，6 min/次。(5) 酶標(biāo)山羊二抗IgG聚合體，室溫孵育2 h，PBS緩沖液沖洗3次，6 min/次。(6)辣椒根素30 min，沖洗3次，6 min/次。(7)顯色：DAB 室溫下顯色，顯微鏡下控制顯色的時(shí)間(5 min左右)，當(dāng)鏡下出現(xiàn)棕黃色顆粒后，自來(lái)水沖洗 10 min，用蘇木精復(fù)染。(8)經(jīng)過(guò)乙醇梯度脫水和二甲苯透明后，中性樹(shù)膠封片。在顯微鏡下放大倍數(shù)(20×10)，拍照，進(jìn)行雙盲法統(tǒng)計(jì)分析。由兩位病理人員進(jìn)行，每組隨機(jī)選取5只大鼠，每只大鼠免疫組化10張片子，每張片子選取5個(gè)視野，進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)，最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 血常規(guī) 缺氧組與常氧組比較，RBC、Hb及Hct差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。缺氧7d組、缺氧14d組、缺氧28d組大鼠的RBC、Hb、Hct水平均高于常氧組(P<0.05);隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，RBC、Hb、Hct水平逐漸升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同缺氧時(shí)間下大鼠血常規(guī)結(jié)果

2.2 RT-PCR結(jié)果 缺氧組大鼠骨髓MMP-9表達(dá)量與常氧組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)其水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖1。

表2 MMP-9 mRNA表達(dá)水平

注：*與常氧組比較P<0.05；△與缺氧7d組比較P<0.05;▲與缺氧14d組比較P<0.05圖1 MMP-9 mRNA表達(dá)水平

2.3 免疫組化染色法結(jié)果 缺氧組大鼠骨髓MVD與常氧組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，其水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2、3及表3。

表3 各組骨髓MVD變化

注：*與常氧組比較P<0.05；△與缺氧7d組比較P<0.05;▲與缺氧14d組比較P<0.05圖2 骨髓MVD變化

注：A:常氧組；B:缺氧7d組;C:缺氧14d組;D:缺氧28d組;箭頭所指為微血管，棕色環(huán)形結(jié)構(gòu)表示MMP-9陽(yáng)性的微血管圖3 標(biāo)記的微血管(×400)

3 討論

長(zhǎng)期缺氧引起機(jī)體全紅細(xì)胞過(guò)度生成，血容量絕對(duì)增加、紅細(xì)胞變形性下降，使得血液黏滯度增加、血流阻力增大、微循環(huán)障礙；這種血液高凝狀態(tài)進(jìn)而加重各臟器缺血缺氧狀態(tài)，此外，缺血缺氧會(huì)導(dǎo)致引發(fā)骨髓的血管病理變化，如血液黏度增加和血管生成導(dǎo)致微血管增生，以代償供氧[4]。高原低氧人群的“多血質(zhì)面容”，為微血管增生的典型特征。我們的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在慢性間歇低氧條件下，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血細(xì)胞比容隨著低氧時(shí)間延長(zhǎng)，逐漸增加，這也是引起血液黏稠、血流減慢的主要原因，進(jìn)而進(jìn)一步加重缺氧，導(dǎo)致單純性缺氧-繼發(fā)性缺氧的惡性循環(huán)，最終刺激機(jī)體發(fā)生微血管增生以緩解機(jī)體缺血缺氧的狀態(tài)。

此外，在本實(shí)驗(yàn)中，慢性間歇低氧條件下，與常氧組相比，缺氧7d組、缺氧14d組、缺氧28d組大鼠骨髓MVD均明顯增加，并且缺氧28d組大鼠骨髓MVD明顯高于缺氧14d組。隨著慢性間歇低氧時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠骨髓微血管增生增加。我們分析其原因，主要是高原地區(qū)的典型特點(diǎn)是缺氧，在慢性缺氧過(guò)程中，機(jī)體多系統(tǒng)、多臟器發(fā)生一系列病理變化，其中重要變化是紅細(xì)胞增多，血液黏滯度增加，血流減慢，造成組織臟器缺血缺氧，機(jī)體為代償供氧，引起微血管的增生，其研究結(jié)果進(jìn)一步論證了該觀點(diǎn)。

慢性間歇低氧即不同程度的缺氧，類似于缺血/缺氧損傷可引起多器官損傷，在慢性間歇性低氧過(guò)程中，低氧可升高氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物水平，氧化應(yīng)激與炎癥之間存在復(fù)雜關(guān)系，其以不同方式促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生，而隨后的炎癥狀態(tài)和可激活多通路多蛋白的調(diào)控表達(dá)，包括MMP-9等蛋白[15-16]，進(jìn)一步調(diào)控機(jī)體缺血缺氧損傷。

已有研究報(bào)道指出，MMP-9作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族中較為重要的成員之一，主要功能是促進(jìn)血管生成，在腫瘤疾病、腦梗死、腦缺血等缺血缺氧性疾病中研究甚多，參與微血管生成。在該實(shí)驗(yàn)中，缺氧7d組、缺氧14d組、缺氧28d組大鼠骨髓MMP-9表達(dá)明顯高于常氧組，其中缺氧28d組大鼠骨髓MMP-9明顯高于缺氧14d組，缺氧14d組大鼠骨髓MMP-9明顯高于缺氧7d組。隨著低氧時(shí)間延長(zhǎng)，MMP-9表達(dá)逐漸增多。高表達(dá)的MMP-9在骨髓中標(biāo)記微血管后，出現(xiàn)MMP-9陽(yáng)性的微血管數(shù)目也相應(yīng)增多，此外，MMP-9的主要功能之一是促進(jìn)血管生成，且與微血管增生的變化一致，因此，我們推測(cè)，慢性間歇低氧條件下，大鼠骨髓微血管增生MMP-9的高表達(dá)密切相關(guān)。

既往有研究[17-18]指出，大鼠體內(nèi)MMP-9的含量與微血管增生的發(fā)生以及發(fā)展是存在密切聯(lián)系的，其作用的機(jī)制可能是在低氧條件下，機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，促進(jìn)炎性因子產(chǎn)生，激活多條通路，如IL-6-JAK2-STAT3-MMP-9引起機(jī)體組織血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌MMP-9，導(dǎo)致微血管增生。因此，在慢性間歇低氧條件下，大鼠骨髓組織中的MMP-9高表達(dá)與微血管的增生密切相關(guān)。

綜上所述，本研究顯示，慢性間歇低氧可導(dǎo)致大鼠骨髓微血管增生及骨髓組織中MMP-9表達(dá)量升高，并且MMP-9的高表達(dá)參與微血管的生成。關(guān)于低氧引起MMP-9高表達(dá)的具體機(jī)制待進(jìn)一步研究。