張 璋 張立琴 杜 瑋 陸薇冰 王巖艷 解 潔 邢泉生

青島大學附屬青島婦女兒童醫(yī)院（山東青島 266000）

高苯丙氨酸血癥（hyperphenylalaninemia，HPA）是由于苯丙氨酸羥化酶（phenylalanine hydroxylase，PAH）或其輔酶四氫生物碟呤（tetrahydrobiopterin，BH4）缺乏導致的血苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）濃度升高的一組氨基酸代謝病，是最常見的先天性常染色體隱性遺傳病?；純后w內(nèi)的Phe不能通過正常代謝途徑轉(zhuǎn)變成酪氨酸，導致旁路代謝增強，產(chǎn)生大量苯丙酮酸、苯乙酸和苯乳酸并從尿中排除出，患兒尿液、汗液有鼠臭味。增高的血Phe 可以通過血腦屏障，引起腦髓鞘發(fā)育不良或脫髓鞘等腦白質(zhì)異常而導致神經(jīng)系統(tǒng)損害。未規(guī)范治療的HPA患兒隨著年齡增長，智能發(fā)育落后明顯，可出現(xiàn)行為、性格、神經(jīng)認知等異常，嚴重者可出現(xiàn)癲癇發(fā)作等。因HPA的癥狀缺乏特異性，易誤診為腦性癱瘓、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。但HPA 是一種可以治療及預防的疾病，盡早明確診斷并早期干預可以改善預后，提高患兒的生存質(zhì)量。

中國大陸HPA 的發(fā)病率約為1/11000[1]。2014年《高苯丙氨酸血癥的診治共識》將HPA 分為PAH缺乏癥和BH 4 缺乏癥兩大類[2]，其中PAH 缺乏癥約占90%[3-4]。PAH基因位于染色體12q22-24.1，全長約90 kb，由13個外顯子及12個內(nèi)含子組成[2]。目前PAHvdb基因庫（http://www.biopku.org/pah/）共收錄了1 158種PAH基因變異。這些變異在不同程度上降低了PAH的催化活性，導致一系列不同的生化結(jié)果和臨床表型。HPA患兒的臨床表型主要由基因型決定[5]，明確基因型有助于指導HPA的分型、判斷預后以及家系內(nèi)的遺傳咨詢。目前，臨床醫(yī)師可以通過Sanger測序及第二代高通量測序等常規(guī)的測序方法，迅速獲得患者確切的基因型。由于PAH基因變異的高度遺傳異質(zhì)性，各個國家的熱點變異位點差異很大[6-8]，我國不同區(qū)域及省份之間PAH基因變異分布不同[9-11]，因此有必要針對特定區(qū)域的人群進行研究。本文旨在構(gòu)建PAH變異基因譜，并根據(jù)變異特點分析基因型與表型的關(guān)系，以期對臨床診斷提供一定的幫助。

1 對象與方法

1.1 研究對象

青島市自1996年開展新生兒疾病篩查起至2018年12月，共篩查新生兒1 622 956人次，確診PAH缺乏癥患兒204例，發(fā)病率1/7956。其中經(jīng)典型苯丙酮尿癥（phenylketonuria，PKU）患兒110例，輕度PKU患兒41例，輕度HPA患兒53例。征得家長同意后，共76例PAH缺乏癥患兒進行基因檢測并納入本研究，分析患兒的PAH基因變異位點，預測臨床表型?；純旱母改讣凹易寰鶡o遺傳代謝病家族史。

本研究已經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，研究對象監(jiān)護人均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集及隨訪 新生兒出生72 小時后（哺乳6～8次以上）采集足跟血，制成專用干血濾紙片進行血Phe濃度測定。自1996年至今，先后采用細菌抑制法或串聯(lián)質(zhì)譜法（MS/MS）進行血Phe濃度測定。血Phe≥120 μmol/L者再次采血復查，仍高者進行診斷及鑒別診斷。所有患兒進行長期隨訪，定期門診復查、監(jiān)測血Phe濃度，并對經(jīng)典型PKU及輕度PKU患兒給予低苯丙氨酸飲食治療。

1.2.2 診斷標準 根據(jù)2014年《高苯丙氨酸血癥的診治共識》[2]，HPA診斷標準為：治療前血Phe濃度均>120 μmol/L（>2 mg/dL），且血Phe與酪氨酸比值（Phe/Tyr）>2.0；應用高效液相色譜分析法進行尿蝶呤譜分析，并行血二氫蝶啶還原酶活性測定及BH4負荷試驗，排除BH4缺乏癥。血Phe≥1 200 μmol/L為經(jīng)典型PKU；血Phe在360～1 200 μmol/L為輕度PKU；血Phe在120～360 μmol/L為輕度HPA。其中輕度PKU及輕度HPA患兒根據(jù)后期隨訪結(jié)果進一步明確診斷，若后期隨訪中輕度PKU患兒血Phe≥1 200 μmol/L診斷為經(jīng)典型PKU，輕度HPA患兒血Phe >360 μmol/L診斷為輕度PKU。

1.2.3 基因檢測及驗證 用EDTA 抗凝管抽取患兒外周靜脈全血3 mL，過柱法提取DNA，應用第二代高通量測序技術(shù)對PAH 的相關(guān)基因進行直接測序，用多重連接酶探針依賴擴增（multiples ligationdependent probe amplification，MLPA）檢測PAH基因是否存在大片段缺失或重復，并應用 Sanger測序?qū)ζ涓改傅腜AH基因相應突變位點進行檢測并驗證。所有突變位點均輸入PAHvdb數(shù)據(jù)庫進行查閱。所有新發(fā)現(xiàn)的突變位點均通過檢索千人數(shù)據(jù)庫（http://www.internationalgenome.org/）、dbSNP數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP）排除多態(tài)性位點。

1.2.4 變異位點特定值設定 根據(jù)PAH 體外酶的活性，參照Guldberg 等[5]的方法將各種變異分類輸入PAHvdb數(shù)據(jù)庫進行查閱，設定變異的變異位點特定值（assigning value，AV）值，組1代表嚴重的無義變異致使體外酶活性<10%，設定AV=1；組2代表殘余酶活性為10%～30%，設定AV=2；組3代表殘余酶活性為30%～70%，設定AV=4；組4殘余酶活性>70%，設定AV=8。

1.2.5 臨床表型預測模型 以患兒的2個變異等位基因AV值相加預測表型[5]：AV總和為2，預測為經(jīng)典型PKU；AV 總和為3～8，預測為輕度PKU；AV 總和9～16，預測為輕度HPA。有16例患兒的突變位點在PAHvdb數(shù)據(jù)庫中檢測不到PAH體外酶活性，無法進行AV 賦值，則排除在基因型-表型分析模型之外，共有60例患兒納入該模型。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析；非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)范圍）表示，多組間比較采用Kruskal WallisH檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示。采用Spearman進行血Phe濃度和AV評分之和的相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

納入的76例患兒中，男40例、女36例，均為足月兒，平均出生體質(zhì)量（3.47±0.44）kg。經(jīng)典型PKU患兒28例，男15例、女13例；輕度PKU 26例，男15例、女11例；輕度HPA 22例，男10例、女12例。

76例患兒的152個等位基因中檢測出146個變異，檢出率96.1%。見表1。共檢測出變異類型45種，其中錯義變異29種（64.4%），無義變異6種（13.3%），剪接變異4種（8.9%），缺失變異3種（6.7%），同義變異2種（4.4%），發(fā)現(xiàn)1個新位點類型不明。41個（91.1%）變異位點位于外顯子區(qū)，4個（8.9%）位于內(nèi)含子區(qū)。外顯子的突變多集中于E3、E5、E7、E11、E12，分別為6個（13.3%）、5個（11.1%）、6個（13.3%）、6個（13.3）、5 個（11.1%），外顯子E 4、E 13 未檢測出變異位點。在內(nèi)含子區(qū)域檢測出4個變異位點，分別位于I3、I4、I7、I12（圖1）。

2.2 熱點基因變異位點

熱點變異位點為c.728G>A（26/146，17.8%）、c.158G>A（13/146，8.9%）、c.1068C>A（11/146，7.5%）、c.721C>T（10/146，6.8%）；另外c.1238G>C（8/146，5.5%）、c.331C>T（8/146，5.5%）、c.1301C>A（7/146，4.8%）出現(xiàn)頻率也較高。見圖2。

本研究發(fā)現(xiàn)未曾被BIOPKU 數(shù)據(jù)庫報道的新變異1 個：c.95 A>G，該位點致病性不明，有2 例患兒基因型為c.95 A>G/c.1197 A>T，2 例患兒初篩、復篩血Phe濃度分別為552 μmol/L、1 872 μmol/L及966 μmol/L、1 590 μmol/L，均診斷為經(jīng)典型PKU。

圖1 PAH 基因45 種突變的位置分布

圖2 PAH 基因熱點變異位點的占比

2.3 不同臨床類型患兒的基因變異位點

28 例經(jīng)典型PKU 患兒檢測出54 個、共22 種突變位點，最常出現(xiàn)的為c.728G>A（11/54，20.4%）、c.1068C>A（9/54，16.7%）、c.331C>T（5/54，9.3%）和c.1238G>C（5/54，9.3%）。

26例輕度PKU患兒檢測出50個、共25種突變位點，最常出現(xiàn)的為c.728G>A（9/50，18.0%）、c.721C>T（7/50，14.0%）、c.1301C>A（5/50，10.0%）和c.1238G>C（3/50，6.0%）。

22例輕度HPA患兒檢測出42個、共24種突變位點，最常出現(xiàn)的為c.158G>A（12/42，28.6%）、c.728G>A（6/42，14.3%）。見表2。

其中有c.331 C>T、c.1068 C>A、c.728 G>A、c.611A>G、c.739G>C、c.721C>T和c.842+2T>A共7個變異位點在三組中均有檢出。有12種變異位點僅在輕度HPA中檢出，分別為c.1024G>A、c.1256A>G、c.1215_1219delAATAC、c.320A>G、c.1174T>A、c.889 C>A、c.800 A>T、c.620 A>G、c.301 G>A、c.491T>C、c.505C>T和c.212G>A。

2.4 HPA患兒的基因型

76例患兒的基因型見表1，其中69例檢測出2個變異位點，分別源自其父母；1例檢測到的2個突變位點1個源自其父親、另1個系自身變異，其母親未檢測到相應變異位點。另外6 例患兒只檢測到1 個源自其父或母的變異位點。

輕度HPA 出現(xiàn)頻率最高的基因型為c.728 C>T/c.158G>A，有3例，占比13.6%（3/22），是輕度HPA的熱點基因型。

70 例檢測出2 個變異等位基因的患兒中，3 例為純合變異，其余67 例為復合雜合變異。3 例純合變異患兒中1例基因型為c.721C＞T、c.721C＞T，臨床診斷為輕度PKU（初篩為237 μmol/L、復篩為399 μmol/L），根據(jù)基因型預測為輕度HPA；另2 例基因型為c.728C>T、c.728C>T，其中1例診斷為經(jīng)典型PKU，另1 例診斷為輕度PKU，根據(jù)基因型預測為經(jīng)典型PKU。

表1 76例患兒的基因型、表型及預測表型

續(xù)表1

表2 PAH缺乏癥患兒熱點基因突變結(jié)果[n(%)]

2.5 基因型-表型的相關(guān)性

60例患兒的基因型突變位點可以在PAHvdb數(shù)據(jù)庫中檢測到AV值及PAH體外酶的活性，納入基因型-表型分析模型（表3）。根據(jù)兩個等位基因的AV 評分之和預測患兒的臨床表型，并與患兒最終臨床診斷進行比較分析，三組由基因型預測的表型與患兒臨床表型的一致率（陽性預測值）達81.7%，其中輕度HPA的預測一致率最高，達93.3%，其次是輕度PKU，達80.0%，最低的是經(jīng)典型PKU，為76.0%。3組預測的靈敏度分別為經(jīng)典型PKU 82.6%，輕度PKU 72.7%，輕度HPA 93.3%。

表3 60例患兒基因型-表型預測分析

所有患兒治療前的血Phe濃度見表1，經(jīng)典型PKU、輕度PKU、輕度HPA組治療前血Phe濃度均值分別為（1 484.21±315.54）μmol/L、（632.56±212.68）μmol/L、（175.54±48.77）μmol/L。三組間血Phe濃度差異有統(tǒng)計學意義（F=211.332，P<0.001）。

所有患兒的AV評分之和見表1。應用Spearman進行血Phe濃度和AV值之和的相關(guān)性分析，治療前患兒血Phe水平與AV評分之和呈顯著負相關(guān)（r=－0.83，P<0.001），即PAH剩余酶活性越高，患兒血Phe濃度越低。

2.6 隨訪

對所有患兒進行長期隨訪（2.5～22年），并檢測血Phe 的濃度。其中有1 例患兒初篩、復篩血Phe 均不超過360 μmol/L（244.8 μmol/L、210 μmol/L），后期監(jiān)測血Phe濃度超過360 μmol/L，診斷為輕度PKU，立即予控制飲食治療。對輕度HPA的長期隨訪發(fā)現(xiàn)有2例患兒定期檢測血Phe濃度均<120 μmol/L。未發(fā)現(xiàn)輕度PKU轉(zhuǎn)為經(jīng)典型PKU患兒。

3 討論

PAH缺乏引起的HPA是氨基酸代謝疾病中最常見的遺傳代謝病，缺乏規(guī)范治療的患兒會影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，甚至造成心理行為的改變。早期合理化的飲食治療可以改善遠期預后。但目前臨床上對某些HPA早期的準確診斷仍有一定困難，如因肝功能發(fā)育不完善可以引起早產(chǎn)兒一過性血Phe 升高，或存在感染、發(fā)熱、腸道外營養(yǎng)或輸血等情況時，也可以引起新生兒血Phe 升高。隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，臨床醫(yī)師更容易在新生兒早期獲得患兒準確的分子遺傳學診斷?；純旱幕蛐褪桥R床表型的主要決定因素。PAH基因變異在不同地區(qū)人群中分布不同，代謝表型也存在較大的差異。因此，構(gòu)建每個地區(qū)的PAH基因變異譜可更好地研究基因變異與表型的關(guān)系，更好地服務于臨床，完善中國不同地區(qū)PAH基因變異譜的構(gòu)成。HPA的早期診斷不僅有助于改善患兒的預后，還可對患兒家屬提供遺傳咨詢方面的幫助，為先證者家庭提供孕前產(chǎn)前診斷咨詢，做好二級預防，進一步優(yōu)化人口質(zhì)量，降低人口出生缺陷率。

本研究在76例PAH缺乏癥患兒中共檢測出45種變異，檢出率約為96.1%，基因變異型以錯義變異為主，占66.7%，與其他研究及PAHvdb數(shù)據(jù)庫記錄的結(jié)果相符[9-10]。本研究顯示，青島地區(qū)PAH缺乏癥患兒檢出PAH基因變異91.1%位于外顯子上，變異位點的分布模式多集中在E3、E5、E7、E11、E12，也與其他研究結(jié)果一致[9-10]。

青島地區(qū)PA H基因變異頻率最高的位點為c.728G>A（26/146，17.8%），與中國大陸地區(qū)大樣本測序研究結(jié)果相符[10]，與中國西北地區(qū)（甘肅省、陜西省、寧夏省、青海省、新疆?。⑸虾Ｊ?、河南省、浙江省等地區(qū)PAH基因變異的特征一致[9,11-13]。c.158G＞A位點亦是青島地區(qū)的熱點變異（13/146，8.9%），該位點在浙江地區(qū)變異頻率較高[9]，c.1068C＞A在青島地區(qū)出現(xiàn)頻率也較高（11/146，7.5%）與中國大陸地區(qū)、中國西北地區(qū)大樣本測序研究結(jié)果一致[10-11]，該位點在浙江、上海地區(qū)變異頻率較低。c.721C>T是中國臺灣地區(qū)最常見的變異位點[14]，在青島地區(qū)出現(xiàn)的頻率也較高（10/146，6.8%），亦是上海市、浙江省的熱點變異基因，該位點在中國西北地區(qū)變異頻率也較高[11]。另外c.1238G>C（8/146，5.5%）位點在青島地區(qū)檢出率較高，該位點是中國西北地區(qū)的熱點變異基因[11]，中國大陸地區(qū)大樣本測序尤其是北方地區(qū)變異頻率較高[10]。c.331C>T（8/146，5.5%）位點在青島地區(qū)檢出率與上述地區(qū)大致相同。另c.1301C>A（7/146，4.8%）在青島地區(qū)的檢出率較高，該位點在上述地區(qū)檢出率均不高。

本研究中有一些變異位點在經(jīng)典型PKU、輕度PKU及輕度HPA中均可檢出，包括c.331C>T、c.1068C＞A、c.728G＞A、c.611A>G、c.739G>C、c.721C＞T、c.842+2T>A共7個位點。而c.1024G>A、c.1256A>G、c.1215_1219delAATAC、c.320A>G、c.1174T>A、c.889 C>A、c.800 A>T、c.620 A>G、c.301 G>A、c.491T>C、c.505C>T、c.221G>A這12個位點僅在輕度HPA中檢出。研究顯示，基因型的兩個變異位點中較溫和的變異位點（剩余酶活性高的變異位點）占主導地位，即決定基因型的表型[5]。因此，若在HPA 患兒的基因型中檢出這12個位點，提示患兒為輕度HPA的可能性大。

本研究中6 例患兒只檢測到1 個變異位點，另有10 例患兒變異位點PAHvdb 數(shù)據(jù)庫未查閱到AV 值，即PAH 體外酶的活性未知，故這些患兒未納入基因型-表型分析模型，60例患兒納入基因型-表型預測分析。本研究顯示，基于基因型可以較好地預測患兒的臨床表型，總體準確率高達81.6%。經(jīng)典型PKU、輕度PKU、輕度HPA的預測一致率分別為76%、80%、93.3%。1998年首次提出根據(jù)體外PAH酶活性下降程度對變異進行分類并根據(jù)基因型預測表型，預測表型與患兒實際表型一致率高達79%[5]，與本研究的預測率相似。2013年上海地區(qū)對272例HPA患兒進行的基因型預測表型分析，總預測表型符合率約為54.1%，其中經(jīng)典型PKU 的預測率最高為61.8%，輕度變異組的一致率最低為32.7%[15]，各組預測率低于本研究結(jié)果。

在本研究的基因型-表型的預測結(jié)果中，預測型和患兒臨床表型存在差異的大多只相差1個表型，例如根據(jù)基因型預測為經(jīng)典型PKU共25例，其中19例臨床診斷與預測型相符，6 例臨床診斷為輕度PKU。導致這一結(jié)果的可能原因是一些患兒的血Phe濃度在臨床表型分類的界值附近，因而臨床診斷時被分到相鄰的表型中。其他研究者亦有同樣觀點[15]。本研究中僅有1例患兒臨床表型和預測型相差較大，基因型為c.158G＞A/c.526C＞T，預測為輕度HPA，而臨床診斷為經(jīng)典型PKU。其他預測為輕度HPA患兒共14例，臨床診斷均與預測型相符。

本研究中3 例患兒的基因型是純合突變，其中1例基因型為c.721C>T/c.721C>T，血Phe濃度初篩為237 μmol/L、復篩為399 μmol/L，臨床診斷為輕度PKU，根據(jù)基因型預測為輕度HPA；2 例基因型為c.728G>A/c.728G>A，根據(jù)基因型預測為經(jīng)典型PKU，但實際上只有1 例臨床診斷為經(jīng)典型PKU，而另1 例臨床診斷為輕度PKU。2 個純合變異的基因型一致，而臨床表型不同。根據(jù)之前的相關(guān)研究提示，c.728G>A位點作為在中國大陸的PAH變異高頻位點，在經(jīng)典型PKU 及輕度PKU 患者中出現(xiàn)頻率均較高，這表明攜帶某些特殊變異位點（如c.728 G>A）的患兒其臨床表型受基因型、血Phe濃度及其他因素共同影響[15-16]。

本研究對所有患兒進行了長期隨訪，73例患兒的最終診斷與初步診斷相符。1例患兒初篩、復篩血Phe分別為336 μmol/L、210 μmol/L，診斷為輕度HPA，未進行控制飲食治療，后期隨訪過程中患兒血Phe超過360 μmol/L，最終診斷為輕度PKU，給予控制飲食治療。這例患兒根據(jù)基因型預測表型與臨床最終診斷相符。還有2例輕度HPA患兒長期隨訪顯示血Phe均不超過 120 μmol/L，其中1例患兒目前1歲，基因型為c.331C>T/c.158G>A，另1例患兒目前1.5歲，基因型為c.620A>G/c.301G>A，均在隨訪中，未治療。對于基因測序發(fā)現(xiàn)2個PAH變異位點即基因診斷確定為HPA的患兒，長期隨訪血Phe<120 μmol/L，國內(nèi)未見相關(guān)報告。韓國1項關(guān)于PAH基因c.158G>A 的研究顯示，1例患兒的父親基因型為c.158G>A/c.158G>A純合變異，但未出現(xiàn)HPA，原因尚不明確[17]。本研究認為，對于這類患兒，雖然基因診斷明確，但PHA 剩余酶活性高，可維持患兒體內(nèi)血Phe濃度正常，可以不用長期控制飲食治療。這些患兒可能晚發(fā)病或者終生不發(fā)病，可進行長期隨訪、監(jiān)測血Phe濃度，在遇到可能引起血Phe濃度升高的情況，如患兒合并感染、膿毒血癥、慢性腎衰竭、2 型糖尿病、創(chuàng)傷等時，要加強對血Phe濃度的監(jiān)測，必要時根據(jù)血Phe濃度調(diào)整治療方案[18-19]。

綜上所述，本研究構(gòu)建了青島地區(qū)PAH基因的變異譜，確定本地區(qū)PAH基因變異區(qū)域的分布和常見的變異位點，根據(jù)已知的PAH體外酶活性，分析本地區(qū)患兒的基因型和表型的關(guān)系，為臨床及時診治及預后評估提供依據(jù)；并通過構(gòu)建基因型-表型預測系統(tǒng)，提高患兒的診斷準確率，有利于長期隨訪判斷患兒預后，防止過度治療，減輕患兒家長精神壓力。