樊 曄 尹 華 胡紹燕 何廣勝 盧 俊 肖佩芳 李 捷 何海龍

1.蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液科(江蘇蘇州 215000）；2.江蘇省人民醫(yī)院血液科（江蘇南京 210000)

獲得性再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一種多病因引起的骨髓造血衰竭性疾病。目前認(rèn)為AA 的主要發(fā)病機(jī)制是T 細(xì)胞過度免疫活化對(duì)自身骨髓造血細(xì)胞的破壞所導(dǎo)致的骨髓造血衰竭[1]。隨著免疫抑制治療（immunosuppressive therapy，IST）和造血干細(xì)胞移植技術(shù)的廣泛應(yīng)用，AA 患者的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)[2]。20 世紀(jì)90 年代，部分診斷為AA 的患者在疾病后期進(jìn)展為陣發(fā)性血紅蛋白尿（paroxysmal hemoglobinuria，PNH）、骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）/急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）克隆性疾病，并提出AA 存在克隆性造血的假設(shè)[3]。但由于當(dāng)時(shí)技術(shù)的局限性，常規(guī)的染色體檢測(cè)難以證明AA 克隆性造血的發(fā)生。隨著二代測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)，檢測(cè)到AA中常伴有與惡性克隆性疾病中相同的體細(xì)胞變異[4]，而這些體細(xì)胞變異與AA 的克隆性造血有極大的相關(guān)性，但是對(duì)于導(dǎo)致AA克隆性造血的體細(xì)胞基因變異在兒童及成人AA中的特征，目前相關(guān)報(bào)道很少。本文收集293例兒童及成人AA 患者的二代測(cè)序基因檢測(cè)結(jié)果，探討其25種髓系腫瘤相關(guān)基因變異的特點(diǎn)與臨床意義。

1 臨床資料

以2014年9月至2018年6月蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院、江蘇省人民醫(yī)院收治的293例AA患者為研究對(duì)象。入選者均根據(jù)血常規(guī)、骨髓涂片、多次骨髓活檢、染色體及FISH 等檢查結(jié)果，初次診斷為AA；并排除先天性AA及繼發(fā)性AA。其中，按照初次診斷年齡分為兒童青少年組（0～18歲）及成人組（>18歲）。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二代測(cè)序及分析步驟：①建立含目標(biāo)基因的全基因組文庫，從血液中提取3～5 μg DNA，采用Covaris S2超聲儀進(jìn)行超聲片段化，然后進(jìn)行末端補(bǔ)平、連接adaptor、PCR等步驟，從而建立含目標(biāo)基因的全基因組文庫，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)；②使用麥基諾公司專利開發(fā)的相關(guān)液相捕獲試劑盒和委托的基因組文庫（其中包括髓系腫瘤相關(guān)的25個(gè)基因：ASXL1、CBL、DNMT3A、ETV6、EZH2、IDH1、IDH2、JAK2、NRAS、KRAS、RUNX1、SETBP1、SF3B1、SRSF2、TET2、TP53、U2AF1、ZRSR2、CALR、MPL、SH2B3、CSF3R、BCOR、BCORL1、PIGA）混合，Target region相關(guān)基因片段就被雜交到探針上；③將樣本文庫與基因探針進(jìn)行富集、清洗及洗脫、純化、PCR等步驟，從而捕獲富集目標(biāo)基因文庫；④利用新一代測(cè)序儀illumina HiSeq 2500進(jìn)行高通量測(cè)序；⑤利用SNP分析及InDel分析，從而確定變異位點(diǎn)發(fā)生的基因、坐標(biāo)、mRNA位點(diǎn)、氨基酸改變、變異類型（錯(cuò)義變異/無義變異/可變剪切位點(diǎn)）、影響蛋白功能預(yù)測(cè)（氨基酸插入/氨基酸缺失/移碼變異）等。⑥對(duì)于變異陽性患者，取口腔黏膜進(jìn)行驗(yàn)證。

重型再生障礙性貧血（severe aplastic anemia，SAA）、極重型再生障礙性貧血（very severe aplastic anemia，VSAA）或有輸血依賴的非重型再生障礙性貧血（non-severe aplastic anemia，NSAA）選用聯(lián)合免疫抑制治療；其余NSAA或因經(jīng)濟(jì)問題拒絕使用ATG的患者選用口服環(huán)孢霉素A（cyclosporine A，CsA）治療，兩種治療方法可聯(lián)合或不聯(lián)合使用雄激素、中藥制劑口服，并根據(jù)需要予血制品輸注、防治感染及祛鐵治療等。①聯(lián)合免疫抑制治療：靜脈滴注豬抗人淋巴細(xì)胞免疫球蛋白（porcine anti-human lymphocyte immunoglobulin，p-ALG），25 mg/(kg·d)×5 d，或兔抗人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白（rabbit anti-human thymocyte immunoglobulin，r-ATG），2.5 mg/(kg·d)或3.75 mg/(kg·d)×5 d。首日r-ATG/p-ALG治療之前進(jìn)行藥物靜脈敏感試驗(yàn)，r-ATG/p-ALG治療期間為防治過敏反應(yīng)，均聯(lián)合應(yīng)用甲潑尼龍，治療后為預(yù)防血清病反應(yīng)繼續(xù)予甲潑尼龍靜滴，3周后減停；r-ATG/p-ALG治療結(jié)束后聯(lián)合CsA，5 mg/(kg·d)，口服，q12h，調(diào)整用藥劑量使藥物濃度前3個(gè)月維持在150～250 ng/dL，后維持在100～250 ng/dL。②口服CsA，5 mg/(kg·d)，q12 h，調(diào)整用藥劑量使藥物濃度前3個(gè)月維持在150～250 ng/dL，后維持在100～250 ng/dL。

定期門診隨訪或電話隨訪，記錄6個(gè)月后的療效。AA免疫抑制治療反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)參見2016年英國(guó)AA診治指南中對(duì)于AA免疫抑制治療反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)[4]。

293例AA患者中蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院患兒111例，江蘇省人民醫(yī)院患者182例；男155例、女138例，中位年齡20.0歲（范圍1月齡～85歲）；其中嬰幼兒（0～3歲）16例，學(xué)齡前兒童（～7歲）53例，學(xué)齡兒童（～12歲）44例，青少年（～18歲）29例，青壯年（～40歲）81例，中年（～65歲）54例，老年（>65歲）16例；NSAA共178例，SAA及VSAA共115例。

293 例AA 患者中，19 例檢出髓系腫瘤相關(guān)基因變異，總變異率為6.48%（19/293）。發(fā)生變異的基因共10種：KRAS、ASXL1、PIGA、TP53、BCOR、TET2、SF3B1、DNMT3A、SH2B3、MPL；其中變異最多的基因?yàn)門ET 2，共5 例，變異率為1.71%；其余KRAS、SF3B1、MPL各1例（0.3%），ASXL1、PIGA、TP53、BCOR、DNMT3A、SH2B3各2例（0.7%）。見表1。19例檢出基因變異者中，18 例為單基因變異，1 例同時(shí)存在ASXL1及BCOR基因變異。男性基因變異者6例，變異率3.9%（6/155）；女性基因變異者13例，變異率9.4%（13/138），兩者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.71，P=0.054）。16例嬰幼兒患者中未檢出變異者，53例學(xué)齡前兒童檢出1 例（1.9%），44 例學(xué)齡兒童檢出1 例（2.3%），29例青少年檢出2例（6.9%），81例青壯年檢出6例（7.4%），54例中年檢出7例（13.0%），16例老年檢出2例（12.50%），變異率呈現(xiàn)隨年齡增長(zhǎng)而增加的趨勢(shì)。兒童青少年變異率為2.82%（4/142），成人變異率為9.9%（15/151），兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.0，P=0.014）。178例NSAA患者中14例有變異，變異率為7.8%；115例SAA及VSAA患者中5例有變異，變異率為4.4%，兩者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.43，P=0.233）。

表1 19例髓系腫瘤基因突變陽性AA患者信息

293 例患者中，放棄治療3 例，治療后失訪或死亡32 例，其余258 例患者均進(jìn)行IST 治療，并至少隨訪6個(gè)月。6個(gè)月后，19例檢出變異者IST治療有效14例，有效率73.7%；239例未檢出變異者，151例有效，有效率63.2%；兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.84，P=0.359）。變異組（n=19）中，成人患者IST治療6個(gè)月有效率為73.3%（11/15），兒童青少年患者有效率為75.0%（3/4），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.000）；無變異組（n=239）中，成人患者有效率為61.7%（82/133），兒童青少年患者有效率為65.1%（69/106），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.30，P=0.584）。

5例TET2變異者均為成人患者，4例女性、1例男性，4例NSAA、1例SAA；主要氨基酸改變類型為：3個(gè)錯(cuò)義變異、2個(gè)移碼變異、1個(gè)終止變異；p.G1137S、p.G1137fs、p.C973X、p.I1762V、p.N488S為發(fā)生的氨基酸改變。3例治療有效。

根據(jù)基因作用機(jī)制，將10 種變異基因分為表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其他組。表觀遺傳學(xué)組包含有ASXL1、TET2、DAMT3A、BCOR/BCORL1，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子組為TP53，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路組有KRAS、MPL、SH2B3，其他組主要為PIGA、SF3B1。各變異類型分組與無變異組療效相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.9）；10例表觀遺傳學(xué)變異者，7例治療有效，有效率70.0%（7/10）。見表2。

表2 根據(jù)不同基因作用機(jī)制分組療效比較[n(%)]

2 討論

再生障礙性貧血是由多種病因引起的骨髓造血衰竭癥，目前普遍認(rèn)為AA 存在克隆演變，其轉(zhuǎn)化為MDS/AML 的風(fēng)險(xiǎn)是15%，演化為PNH 的風(fēng)險(xiǎn)是10%。MDS、AML 及PNH 三者均具有血液腫瘤的特征。在分子水平上，腫瘤發(fā)生一方面是癌基因激活，促進(jìn)細(xì)胞增殖，另一方面是抑癌基因失活或受抑，促進(jìn)細(xì)胞惡變?；蜃儺惤?jīng)常發(fā)生，但部分變異可能構(gòu)成惡變的始動(dòng)過程，若此時(shí)體內(nèi)免疫系統(tǒng)喪失免疫監(jiān)視功能，腫瘤便會(huì)發(fā)生。AA患者主要的發(fā)病機(jī)制便是免疫功能障礙，這本身就是腫瘤發(fā)生的易感因素。AA向PNH、MDS/AML 的進(jìn)展可能與體內(nèi)某些癌基因、抑癌基因的變異有關(guān)。

近年來對(duì)AA髓系腫瘤基因變異的研究報(bào)道逐步增多。然而，各研究報(bào)道中的樣本特點(diǎn)及目標(biāo)基因各不相同，得出的結(jié)論也有一定的差異[4-8]。對(duì)比國(guó)外相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，盡管本研究樣本量較多，但是檢測(cè)目標(biāo)基因少，樣本中位年齡小，因此檢出的突變率處于相對(duì)較低的水平。

本研究發(fā)現(xiàn)，成人AA 的髓系腫瘤基因變異率較兒童高，在此之前也有學(xué)者得出相似結(jié)論。相關(guān)研究對(duì)439例AA檢測(cè)106個(gè)基因突變，36%患者檢測(cè)到體細(xì)胞突變，且每位患者的突變數(shù)量與年齡呈正相關(guān)，即隨著年齡增長(zhǎng)，體細(xì)胞突變有所增加，特別是DNMT3A和ASXL1變異克隆隨著時(shí)間的推移而擴(kuò)大[4]。相關(guān)研究也提示克隆性造血的患者在確診時(shí)年齡可能更大，且在包括確診年齡、病程等在內(nèi)的多因素logistic回歸分析中，確診年齡與克隆性造血顯著相關(guān)[4]。本研究中兒童青少年變異率為2.82%，明顯低于成人（9.9%）。但是，變異率在不同年齡的區(qū)別是否與自然衰老有關(guān)，目前沒有統(tǒng)一意見，但對(duì)于AML來講，大多數(shù)AML基因組實(shí)際上是在造血干/祖細(xì)胞（HSPC）獲得起始突變之前發(fā)生的隨機(jī)事件，是由少許個(gè)別基因擴(kuò)增、其他基因協(xié)同而決定疾病的特點(diǎn)與預(yù)后[9]。由此認(rèn)為，在AA中的髓系腫瘤基因變異與年齡相關(guān)的差別，更多是由于克隆擴(kuò)增引起，低水平的年齡相關(guān)的克隆可能代表克隆創(chuàng)始階段，后期的克隆擴(kuò)增引起惡性疾病發(fā)生；即在AA中，小的和相對(duì)大的疾病克隆群體的檢測(cè)可能表明克隆進(jìn)化的不同階段而不是正常的衰老[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，髓系腫瘤基因變異對(duì)AA 的聯(lián)合免疫治療療效沒有影響，這一結(jié)論與相關(guān)研究相似，但在相關(guān)研究中，PIGA、BCOR/BCORL1變異對(duì)免疫治療效果更好，而DNMT3A、ASXL1、TP53、RUNX1及CSMD 1變異對(duì)免疫抑制治療反應(yīng)更差[4]。同時(shí)也有研究指出DNMT3A和TET2可以降低AA進(jìn)展為AML的風(fēng)險(xiǎn)，TP53和剪接體基因（包括U2AF1）變異也與較差的預(yù)后有關(guān)，同一個(gè)體中存在的多個(gè)變異的影響是倍增的，預(yù)計(jì)更多數(shù)量的變異會(huì)增加進(jìn)展為AML的風(fēng)險(xiǎn)[10]。由于本研究檢出某一特定基因變異人數(shù)較少，對(duì)發(fā)生率相對(duì)較高的TET 2及表觀遺傳學(xué)變異進(jìn)行分析，結(jié)果對(duì)療效無影響，對(duì)于此差異，可能與各研究樣本量、隨訪時(shí)間等不同有關(guān)。

綜上所述，檢測(cè)25種髓系腫瘤相關(guān)基因，基因變異發(fā)生率與年齡有關(guān)，而變異發(fā)生率與性別、AA分類無關(guān)；在療效方面，本研究中有無髓系腫瘤基因變異與聯(lián)合免疫治療的療效無差別，且在不同年齡組內(nèi)差別無統(tǒng)計(jì)意義，與近期國(guó)外相關(guān)研究結(jié)果有相似也有不同的結(jié)論，期待更多的樣本量及更長(zhǎng)隨訪時(shí)間的研究。