朱成琳 陳廣華 翟 宗 楊琪瑜 呂 慧 李 捷 王 易 胡紹燕

1.蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液腫瘤科（江蘇蘇州 215000）；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院江蘇省血液研究所（江蘇蘇州 215000）

隨著異基因造血干細(xì)胞移植技術(shù)（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）的進(jìn)步和推廣，越來越多的血液及非血液病患者可通過移植實(shí)現(xiàn)痊愈，而巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）感染是allo-HSCT 后的常見嚴(yán)重并發(fā)癥之一。HSCT患者由于免疫功能低下，不能有效清除CMV感染和產(chǎn)生免疫保護(hù)，易發(fā)生原發(fā)性CMV 感染或潛伏的CMV 再激活。在過去的幾十年里，盡管采用更昔洛韋等抗病毒藥物預(yù)防策略及結(jié)合CMV-DNA 檢測的搶先治療已顯著降低CMV 病的發(fā)生率，但仍不能降低CMV病的病死率[1]。除引起局部器官損害以外，CMV 感染還可通過間接作用引起繼發(fā)性細(xì)菌及侵襲性真菌感染、移植物抗宿主病及移植后骨髓衰竭、增加非復(fù)發(fā)相關(guān)死亡率等[2]。本文對allo-HSCT移植后CMV 感染危險因素進(jìn)行分析并對CMV 感染情況進(jìn)行描述，旨在為CMV 感染高?；純旱闹委熀透深A(yù)提供依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 研究對象

回顧分析2016年1月至2018年12月在蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液科進(jìn)行allo-HSCT患兒的臨床資料。研究對象入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡<18 歲；②具有HSCT 指征并進(jìn)行HSCT治療后存活30天及以上患兒；③排除回輸造血干細(xì)胞之前或回輸過程中死亡，輸注造血干細(xì)胞移植后30天內(nèi)因移植相關(guān)事件死亡，二次移植患兒，自體干細(xì)胞移植患兒。研究得到蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

入選研究對象依據(jù)是否感染CMV，分為CMV感染組與無CMV 感染組；根據(jù)對抗病毒治療反應(yīng)將CMV 感染組分為難治性CMV 感染（refractory cytomegalovirus infection，RCI）組及非RCI組。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集及隨訪 采用查詢檢驗(yàn)報告及電子病歷的方式明確發(fā)生CMV 感染及RCI 患兒，通過查詢電子病例進(jìn)行隨訪，對于極少部分后期未再來院繼續(xù)移植后檢查患兒通過詢問其負(fù)責(zé)醫(yī)師了解其后續(xù)情況。

1.2.2 移植患者的CMV預(yù)防與治療 ①CMV感染的預(yù)防：移植前9 天至前2 天所有受者予更昔洛韋，5 mg/kg，每12小時1次，靜脈滴注1周，預(yù)防CMV感染；移植后改用阿昔洛韋，10 mg/kg，每12小時1次，靜脈滴注至移植后1 個月；其后更改為口服預(yù)防，從中性粒細(xì)胞植入至移植后100天內(nèi)，每周1、2次常規(guī)檢測CMV 拷貝數(shù)，移植100 天后至移植后1 年內(nèi)，每2～4 周定量檢測CMV-DNA，直至停用免疫抑制劑；②CMV 感染的治療：移植后第1 天開始定期監(jiān)測CMV拷貝數(shù)狀況，一旦連續(xù)兩次檢測到CMV-DNA拷貝數(shù)≥5×102copies/mL，立即靜脈應(yīng)用更昔洛韋或膦甲酸鈉至CMV-DNA轉(zhuǎn)陰（造血重建差者首選膦甲酸鈉）或靜脈用丙種球蛋白治療，并在病情允許的情況下降低免疫抑制劑用量。CMV 肺炎者加用人CMV免疫球蛋白或人免疫球蛋白治療。

1.2.3 CMV-DNA檢測 采用人CMV核酸定量檢測試劑盒（湖南圣湘生物科技有限公司）進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測全血CMV-DNA拷貝數(shù)，該方法檢測閾值為500 copies/mL，高于該值視為CMV-PCR陽性。

1.2.4 移植后CMV 感染及相關(guān)定義 CMV 感染：連續(xù)兩次在外周血中檢測到CMV-DNA≥500copies/mL[3]。復(fù)發(fā)性CMV感染：間隔28天以上CMV拷貝數(shù)轉(zhuǎn)陰后，再次檢測到CMV拷貝數(shù)上升，可為既往感染CMV 再激活或重新感染CMV。早期CMV 感染：移植后100天內(nèi)發(fā)生CMV感染。晚期CMV感染：移植100天以后發(fā)生CMV感染[3]。RCI：經(jīng)正規(guī)抗病毒治療14天后，CMV-DNA拷貝數(shù)仍上升[4]。CMV病[4-7]：在相關(guān)液體和組織樣本中發(fā)現(xiàn)CMV 感染的同時出現(xiàn)存在終末器官疾病的體征和癥狀（在相關(guān)器官的組織中存在臨床癥狀和/或體征，并有相關(guān)的CMV檢測）。CMV視網(wǎng)膜炎：經(jīng)過專業(yè)眼科醫(yī)師通過眼底檢查確診有相關(guān)視網(wǎng)膜改變。

1.2.5 急性移植物抗宿主?。╝cute graft-versus-host disease，aGVHD）與中性粒細(xì)胞植入 aGVHD 的診斷、分期和分度按照美國西雅圖 FredHutchinson癌癥研究中心關(guān)于aGVHD 的診斷分度及分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷[8]。中性粒細(xì)胞植入：連續(xù)3 天中性粒細(xì)胞計數(shù)（ANC）≥0.5×109/L的第1天[5]。

1.2.6 GVHD預(yù)防方案 親緣全相合造血干細(xì)胞移植（Sib-HSCT）采用霉酚酸酯（MMF）聯(lián)合環(huán)胞霉素A（CsA）或他克莫司（FK506）二聯(lián)預(yù)防 GVHD；無關(guān)供者造血干細(xì)胞移植（URD-HSCT）及單倍體相合造血干細(xì)胞移植（Haplo-HSCT）采用CSA+MMF+短程甲氨蝶呤（MTX）三聯(lián)預(yù)防GVHD。CsA于移植前9天起予3 mg/(kg·d)，每12小時1次，靜脈滴注，監(jiān)測CsA濃度，調(diào)整至維持在150～250 ng/mL，后漸改為口服；FK506濃度維持8～15 ng/mL。MTX于移植后1天、3天、6天及11天給予，首次劑量15 mg/m2，其后為10 mg/m2。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)范圍）表示。計數(shù)資料以百分比表示，組間比較采用χ2、校正χ2或Fisher精確概率法檢驗(yàn)。采用二元logistic回歸模型分析CMV感染及RCI發(fā)生的危險因素。采用Kaplan-Meier分析法分析CMV感染及RCI對總體生存率（OS）及無病生存率（DFS）的影響，并用Log-Rank檢驗(yàn)比較組間差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

共收集患兒269例，其中男167例、女102例；中位移植年齡65個月（33～115個月），最小7個月，最大206個月；中位隨訪時間16.2個月（11.7～25.0個月）。急性白血病148例（急性淋巴細(xì)胞白血病77例、急性髓系白血病71例），骨髓增生異常綜合征（MDS）/骨髓增值性疾?。∕PN） 18例，骨髓衰竭性疾病61例，免疫缺陷病26例，其他病種16例。采用臍帶血造血干細(xì)胞移植（UCBT）81例，外周血造血干細(xì)胞移植（PBSCT）67例，PBSCT聯(lián)合骨髓造血干細(xì)胞移植（BMT）113例，BMT者8 例。Sib-HSCT 33 例，Haplo-HSCT 116 例，URDHSCT120例。257例患兒采用改良 Bu/Cy 為主的預(yù)處理方案，12例伴髓外病變惡性血液病患兒采用含全身照射（TBI）預(yù)處理方案。見表1。

2.2 CMV感染情況

至隨訪終點(diǎn)，共165 例發(fā)生CMV 感染，CMV 感染率61.3%（165/269例），CMV感染發(fā)生時間為移植后23 d（15～34 d），感染持續(xù)時間38 d（25～66 d）。165例患兒中有12例患兒移植前檢測出CMV-DNA。98.1%（162/165）為早期CMV感染，3例為晚期CMV感染，分別在移植后第103、115和148天，持續(xù)時間分別為24、43和20天。14.5%（39/269）患兒發(fā)生復(fù)發(fā)性CMV感染。見表2。

2.3 RCI情況

移植患兒中有17.8%（48/269例）發(fā)生RCI，RCI發(fā)生時間為移植后19.5d（13.0～27.3d），經(jīng)治療后RCI轉(zhuǎn)陰的中位時間為61.5 d（41.0～100.5 d）。見表2。在發(fā)生RCI的患兒中有17例患兒發(fā)生復(fù)發(fā)性CMV感染，3例再次發(fā)生RCI。

RCI組初次檢測到CMV感染時間為移植后19.5 d（13.0～27.3 d），非RCI組為24.0d（16.5～34.0 d），兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=2.58，P=0.010）。

RCI組CMV感染拷貝數(shù)峰值為57 800 copies/mL（21 000～151 250 copies/mL），非RCI組為8 310copies/mL（2 845～23 150 copies/mL），兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=6.82，P<0.001）。

表1 造血干細(xì)胞移植患兒一般資料（n=269）

2.4 CMV病

3.3 %（9/269）的患兒發(fā)生CMV病，占發(fā)生RCI患兒的18.8%（9/48）。其中有3例患兒為CMV肺炎，CMV 肺炎患兒的支氣管肺泡灌洗液均檢測到CMVDNA；CMV肺炎患兒中有1例持續(xù)血便，并在糞便中檢測到CMV-DNA 1.4×105copies/mL。6例患兒發(fā)生CMV 視網(wǎng)膜炎，其中5 例基礎(chǔ)疾病均為濕疹、血小板減少伴免疫缺陷綜合征，且均在移植前檢測到CMVDNA；1例為急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）復(fù)發(fā)后移植。9 例患兒中2 例發(fā)生移植相關(guān)死亡。9 例CMV 病患兒中7例采用臍血移植，2例為單倍體移植。

2.5 CMV感染危險因素分析

與無CMV 感染組相比，CMV 感染組移植年齡>65 個月、惡性血液病、非親緣全相合移植、發(fā)生Ⅱ～Ⅳ級aGVHD的發(fā)生比例較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。二元logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)患兒移植年齡>65個月、移植后發(fā)生Ⅱ～Ⅳ級aGVHD是發(fā)生CMV 感染的獨(dú)立危險因素，親緣全相合移植能降低CMV感染的發(fā)生風(fēng)險（P<0.05）。見表4。

表2 CMV感染患兒分布情況 （n=269）

2.6 RCI危險因素分析

與非RCI 組相比，RCI 組臍血干細(xì)胞來源、發(fā)生Ⅱ～Ⅳ級aGVHD、輸注CD34+細(xì)胞量≤1.009×106/kg、輸注總有核細(xì)胞量≤2.17×108/kg的比例較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。二元logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),發(fā)生Ⅱ～Ⅳ級aGVHD及使用臍血移植與發(fā)生RCI相關(guān)（P<0.05）。見表5。

2.7 CMV感染對預(yù)后的影響

至隨訪終點(diǎn)，入組的269例患兒中17例白血病復(fù)發(fā)，45例死亡（其中32例為移植相關(guān)死亡，13例為原發(fā)疾病復(fù)發(fā)相關(guān)死亡），中位隨訪時間16.2個月（11.7～25.0個月），累積總體生存率78.9%。

CMV 感染組和無CMV 感染組之間OS 及DFS 的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。RCI 組與非RCI 組OS及DFS的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1、圖2。

3 討論

CMV 是一種普遍存于人群中皰疹病毒，在原發(fā)感染后會發(fā)生潛伏感染，在免疫抑制的情況下，可以發(fā)生再激活。CMV感染后有組織嗜性，在免疫低下的個體中，胃腸道及肺部最易被累積，嚴(yán)重者可造成全身性CMV播散[9]。目前治療CMV感染用藥包括更昔洛韋及膦甲酸鈉，但存在骨髓抑制作用和腎毒性，進(jìn)而限制其應(yīng)用。故對移植后CMV 感染及RCI 高?；純旱脑缙谠\治對改善移植預(yù)后仍有重要意義。

表3 CMV感染與無CMV感染組以及RCI組與非RCI組間比較[n(%)]

表4 Logistic回歸分析CMV感染危險因素

表5 Logistic回歸分析RCI危險因素

圖1 不同組間生存曲線比較

圖2 不同組間無病生存率比較

本研究中兒童allo-HSCT 后CMV 感染總體發(fā)生率為61.3%，CMV感染發(fā)生時間為23 d（15～34 d），感染持續(xù)時間38 d（25～66 d），這與相關(guān)研究報道兒童CMV感染發(fā)生中位時間一致[10]。其中單倍體移植中發(fā)生CMV感染的概率為69%，無關(guān)供者中發(fā)CMV感染為60.8%，親緣全相合移植發(fā)生CMV 感染率為36.4%。與相關(guān)研究中單倍體移植患兒CMV 感染的發(fā)生率60.6%接近[11]。單倍體移植發(fā)生CMV 感染率較親緣全相合移植明顯升高，這與相關(guān)研究結(jié)果一致[12]。本研究兒童造血干細(xì)胞移植后發(fā)生RCI 的概率為17.8%，較國內(nèi)RCI的發(fā)生率（29.8%～50.6%）低[13]，但目前針對RCI 的研究對象主要為成年人，兒童RCI的相關(guān)研究較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，患兒移植年齡大、發(fā)生Ⅱ～Ⅳ級aGVHD 是發(fā)生CMV 感染的危險因素，而選擇親緣全相合移植可降低CMV 感染的發(fā)生率。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)年齡偏大兒童移植后發(fā)生CMV 感染風(fēng)險增加[10]。此外，發(fā)生aGVHD 后機(jī)體免疫狀態(tài)遭到破壞及全身性糖皮質(zhì)激素應(yīng)用會抑制宿主的抗病毒免疫反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致病毒清除困難和傳播。治療Ⅱ～Ⅳ級的aGVHD伴隨著更高劑量和更長時間的全身激素使用[14]，將會增加CMV 感染的風(fēng)險。移植后免疫抑制種類及程度顯著影響CMV 感染及RCI 的發(fā)生率[13]，這也能解釋在本研究中97%的CMV感染和RCI患兒發(fā)生在移植后的100天以內(nèi)。既往多認(rèn)為HLA不全相合的移植較全相合移植的CMV 再激活更明顯。HLA 不全相合移植的患者中大多數(shù)發(fā)生了aGVHD，需要接受糖皮質(zhì)激素治療，從而導(dǎo)致CMV 特異性CD 4+和CD 8+T 細(xì)胞免疫恢復(fù)延遲。目前對HLA 不全相合位點(diǎn)對CMV感染的影響已有更進(jìn)一步研究[15]。預(yù)處理方案中使用TBI 及移植中使用ATG 與CMV 感染相關(guān)，但在本研究中未見明顯差異，可能與本研究中使用TBI 預(yù)處理的患兒數(shù)目偏少相關(guān)。

本研究中，移植干細(xì)胞選擇臍血，發(fā)生Ⅱ～Ⅳ級aGVHD 是發(fā)生RCI 的危險因素。臍血移植患兒發(fā)生RCI 較其他干細(xì)胞來源發(fā)生RCI 的風(fēng)險增加2.6 倍。由此可見臍血移植后一旦發(fā)生CMV感染會更難控制，這與相關(guān)研究結(jié)果相似[16]。在臍血移植中往往由于供者CMV血清陰性，無特異性病毒T淋巴細(xì)胞，受者體內(nèi)血清陽性而更易發(fā)生CMV 活化，因此臍血移植后一旦發(fā)生CMV 感染會更難控制。本研究RCI 組首次檢測到CMV 感染時間較非RCI 組早，CMV 感染峰值拷貝數(shù)高，這與相關(guān)研究結(jié)果一致[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，輸注CD 34+細(xì)胞數(shù)目較少是發(fā)生RCI 的危險因素，與相關(guān)報道一致[18]。輸注總有核細(xì)胞較少及中性粒細(xì)胞植入時間延長的患兒RCI發(fā)生比例較高，但并非為獨(dú)立危險因素。本研究中發(fā)生RCI的部分患兒選用臍血移植，而臍血移植中CD34+細(xì)胞及總有核細(xì)胞數(shù)目有限。

兒童無論有無發(fā)生CMV感染，對于OS及DFS的影響未見明顯差異，這與相關(guān)研究結(jié)果一致[18]。但與成人的相關(guān)研究結(jié)論存在差異[1,19]。在一項研究成人和兒童移植后感染預(yù)后的報道中，雖然兒童CMV 感染發(fā)生率不低于成人，但所導(dǎo)致的感染相關(guān)病死率較成人低[20]。且兒童移植后死亡事件和成人存在差異，感染不是兒童死亡首位因素。本研究中RCI 組與非RCI組之間OS及DFS均可見差異，與相關(guān)報道一致[13]?？紤]CMV感染本身帶來的影響，也可能是長期抗毒藥物引起的毒副作用。目前對CMV 再激活能否降低白血病復(fù)發(fā)率現(xiàn)仍有爭議。一項來自國際血液和骨髓移植研究登記處的研究（CIBMTR）認(rèn)為，在AML及骨髓增殖性疾病中CMV 再激活能降低白血病復(fù)發(fā)率[19]。考慮本研究隨訪時間較短，未對CMV 再激活對惡性疾病的復(fù)發(fā)影響作進(jìn)一步分析。

本研究表明，患兒移植年齡偏大，移植后發(fā)生Ⅱ～Ⅳ級aGVHD是發(fā)生CMV感染的危險因素，而選擇親緣全相合移植能降低CMV 感染的發(fā)生。選擇臍血移植及發(fā)生Ⅱ～Ⅳ級aGVHD患兒發(fā)生CMV感染后更難控制，更易發(fā)生RCI。移植后檢測到CMV 感染的時間越早、CMV 感染拷貝數(shù)峰值越高的患兒可能提示發(fā)生RCI 的可能性越大，應(yīng)對這些CMV 感染的高?；純翰扇「芮械腃MV 監(jiān)視和更合理積極的治療方案。