周迪，孫雨琦，史宏志，楊興有 ，周駿，魯喜梅，白若石，陽葦麗，趙園園，秦艷青

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家煙草栽培生理生化研究基地/煙草行業(yè)煙草栽培重點實驗室/煙草農(nóng)業(yè)減害研究中心，鄭州市金水區(qū)文化路95號 450002；

2 四川省煙草公司達州市公司，四川省達州市達川區(qū)七里溝 635000；

3 中國煙草總公司四川省公司，成都市高新區(qū)世紀城路936號 600041；

4 上海煙草集團北京卷煙廠有限公司，北京市通州區(qū)萬盛南街99號 100024

近年來，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和消費水平的提高，雪茄的消費群體不斷增大，國產(chǎn)雪茄產(chǎn)銷量快速增長，對雪茄原料生產(chǎn)和供應(yīng)提出了新的要求。優(yōu)質(zhì)雪茄煙葉不僅要具有良好的抽吸品質(zhì)，更要具備低害安全特性。煙葉中生物堿的組成和含量對煙葉質(zhì)量和有害物質(zhì)煙草特有亞硝胺（TSNAs）的形成具有重要影響[1]。煙草中生物堿的組成主要有四種，分別為煙堿（nicotine, NIC）、降煙堿（nornicotine, NOR）、新煙草堿（anatabine, ANAT）、假木賊堿（anabasine, ANAB）。正常情況下，煙堿含量占總生物堿的92%以上，降煙堿含量不會超過3%，但是在煙株群體中一些煙株會出現(xiàn)煙堿去甲基化酶的突變，使煙堿含量降低，降煙堿含量和比例增加[2]。關(guān)于煙堿轉(zhuǎn)化問題已在白肋煙中已有很多研究[1-3]，但在雪茄煙中則鮮有報道。

生物堿是煙草特有亞硝胺的直接前體物，煙堿、降煙堿、新煙草堿和假木賊堿可在煙葉調(diào)制和調(diào)制后過程中發(fā)生亞硝化反應(yīng)分別形成（NNK）、亞硝基降煙堿（NNN）、亞硝基新煙草堿（NAT）和亞硝基假木賊堿（NAB）[4]，其中NNK 和NNN 已經(jīng)被列為Ⅰ類致癌物[5]，對煙葉的安全性有重要影響[6]。前期研究表明，由于仲胺類的降煙堿比叔胺類的煙堿具有較大的不穩(wěn)定性，更易發(fā)生亞硝化反應(yīng)，因此煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化導(dǎo)致降煙堿含量增高是白肋煙葉中 NNN和TSNAs 總量增加的主要因素[7-9]。通過煙堿轉(zhuǎn)化性狀的遺傳改良、轉(zhuǎn)化株的早期鑒別和去除、低轉(zhuǎn)化品種選育和應(yīng)用等措施來降低煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化是降低白肋煙TSNAs 的有效途徑[10-11]。我國種植雪茄的歷史悠久，但在雪茄煙葉有害成分含量和煙葉減害研究方面的研究卻仍然十分欠缺，雪茄品種煙堿轉(zhuǎn)化問題的原因也不明確。前期初步檢測結(jié)果表明，雪茄煙葉TSNAs 含量水平普遍較高，系統(tǒng)研究不同雪茄品種煙葉TSNAs 的含量及其與生物堿組成和含量等的關(guān)系，對于明晰造成TSNAs 含量增高的深層原因和采取有針對性的措施降低雪茄煙葉 TSNAs 含量，提高雪茄煙葉和制品的安全性具有重要意義。為此，我們在2016—2017 年在四川設(shè)置品種比較試驗，系統(tǒng)分析測定了16 個雪茄煙品種調(diào)制后煙葉TSNAs 及生物堿和硝酸鹽含量，進而分析了TSNAs 含量與前體物含量的關(guān)系，旨在為我國雪茄煙的品種篩選和優(yōu)化，有效降低雪茄煙葉TSNAs 含量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗中的雪茄品種由四川中煙工業(yè)公司長城雪茄廠和CDF 國際公司等單位提供，共計16 個煙葉品種，其中茄衣品種有Cuba4（CX1）、Havana92（CX2）、長城1號（GH-1）、長城2號（GH-2）、Besuki/No（BN）、Cuba-Brazil（CB），茄芯品種包括MNC、MSCA、MFZS、PC、MFPP、OLOR、NJ、DMD、MKK、CP2012。GH-1、GH-2 兩個品種自2010 年開始引種在萬源種植，后經(jīng)過多年系統(tǒng)選擇；CX1、CX2、BN、CB、MNC、MSCA、MFZS、PC、MFPP、OLOR、CP2012 等品種自2011 年開始引種在萬源種植，后進行連續(xù)多年系統(tǒng)選擇，NJ、DMD、MKK 三個品種自2015 年開始在萬源引種種植。

表1 參試的雪茄品種名稱與代號Tab. 1 Name and code of tested cigar varieties

1.2 試驗方法

試驗于2016 年設(shè)在四川達州市萬源縣，土壤肥力中等，有機質(zhì)含量適中。各供試品種隨機區(qū)組排列，重復(fù)3 次。按照雪茄煙生產(chǎn)技術(shù)栽培管理。煙葉采收后，在晾房進行晾制，晾制后的煙葉在自然條件下堆捂發(fā)醇3 周，每個處理均取中部葉2 kg 留樣，煙葉去梗后切碎，冷凍干燥后磨碎，置于冰箱保存待測。

1.3 樣品測定方法

1.3.1 生物堿成分測定

取各處理調(diào)制后煙葉，在堿性條件下，每個重復(fù)取200 mg 樣品進行生物堿的提取，提取試劑為甲基叔丁基醚（MTBE）。提取后的樣品通過Agilent 7890A型（美國Agilent Technologies 公司）氣相色譜-氫火焰離子化檢測器定量分析4 種生物堿（煙堿、降煙堿、假木賊堿、新煙草堿）的含量并以其含量之和作為總生物堿含量，具體步驟參照行業(yè)標準YC/T383-2010。

煙堿轉(zhuǎn)化能力用煙堿轉(zhuǎn)化百分率表示, 即降煙堿含量占煙堿和降煙堿含量之和的百分比, 可由下式計算：

煙堿轉(zhuǎn)化百分率 （PNC）= [降煙堿含量 /（煙堿含量+ 降煙堿含量）] ×100%

1.3.2 硝酸鹽和亞硝酸鹽的測定

采用濃H2SO4-水楊酸法測定煙葉NO3-N 含量，采用磺胺法測定煙葉NO2-N 含量[12]。

1.3.3 TSNAs 成分測定

煙葉樣品在上海煙草集團北京卷煙廠檢測TSNAs含量。測定方法為在線SPE-液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（SPE-LC-MS/MS）法（SPE-LC：Spark Holland，Symbiosis Pico）；（MS/MS：AB Sciex triple quad 5500）[3]。稱取1.0000 g樣品于50 mL錐形瓶，加入40 μL 4種氘代內(nèi)標溶液和30 mL 100 mmol/L乙酸銨溶液，在室溫下以轉(zhuǎn)速200 r/min振蕩萃取60 min后過0.45 μm水相濾膜，收集濾液采用LC-MS/MS檢測TSNAs含量。4種TNSA含量之和即為TSNAs總量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016 和Excel 軟件進行數(shù)據(jù)分析和制圖；使用SPSS 17.0 軟件進行方差分析，用Duncan's對雪茄煙葉生物堿、氮氧化物和TSNAs 等指標進行方差分析和方差齊性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同雪茄品種TSNAs 及其前體物含量分析

2.1.1 不同雪茄品種生物堿含量和煙堿轉(zhuǎn)化率分析

由表2 可知，不同雪茄品種煙葉生物堿含量存在顯著差異。所有參試品種總生物堿含量范圍為1.74%～6.05%，總生物堿的平均值為3.63%。煙堿含量變化范圍為1.14%～5.42%，平均為3.02%，降煙堿含量的變化范圍為0.11%～1.47%，平均值0.40%。四種生物堿以降煙堿變異性較大，品種間存在顯著差異，新煙草堿和假木賊堿變異性較小。

表2 雪茄不同品種生物堿和硝酸鹽含量及煙堿轉(zhuǎn)化率Tab. 2 The content of alkaloids and nitrate and the conversion of nicotine in different cigars

雪茄煙葉中存在較為嚴重的煙堿轉(zhuǎn)化問題，煙堿轉(zhuǎn)化率范圍為5.03%～53.12%，平均值為12.66%，品種間煙堿轉(zhuǎn)化率的變異系數(shù)高達101.01%，說明在不同品種間存在著較大的差異。煙堿含量與降煙堿含量呈現(xiàn)相反的變化趨勢。

從總體上看，茄芯品種與茄衣品種的TSNAs 前體物質(zhì)存在顯著的差異。與茄衣品種相比，茄芯品種的生物堿總量、煙堿含量、假木賊堿和新煙草堿含量的平均值較大，降煙堿含量和煙堿轉(zhuǎn)化率的平均值較低，變異系數(shù)較小。表明茄衣品種總生物堿含量較低，但是煙堿轉(zhuǎn)化率較高，平均降煙堿含量高于茄芯煙葉。

2.1.2 不同雪茄煙品種煙葉硝酸鹽含量的差異

分析結(jié)果表明（表2），雪茄煙葉硝酸鹽含量遠遠大于亞硝酸鹽含量，不同雪茄品種硝酸鹽含量變化范圍相對較小，平均值為1260.95 μg/g，亞硝酸鹽含量的平均值為28.62 μg/g，與降煙堿含量和煙堿轉(zhuǎn)化率相比，硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的變異系數(shù)在品種間的差異較小，這可能是由于試驗的土壤條件和栽培管理較為一致，而硝酸鹽和亞硝酸含量受栽培條件影響相對較大。所有品種中，BN 硝酸鹽含量最高，其次為DMD，以O(shè)LOR 品種的硝酸鹽含量最低。

2.2 不同雪茄煙品種煙葉TSNAs 含量分析

由表3 可知，不同雪茄品種的TSNAs 含量及組成具有顯著差異，不同雪茄品種的TSNAs 變異范圍為181.74～7759.1 ng/g，平均值為3010.98 ng/g。TSNAs各組分平均含量以NNN 含量最高，平均值為1616.59 ng/g，且NNN 含量的變異性最大，從最小值的90.03 ng/g 到最大值的6643.86 ng/g，變異系數(shù)為0.97， NNN 含量的變化趨勢與降煙堿含量和煙堿轉(zhuǎn)化率一致，表明煙堿轉(zhuǎn)化導(dǎo)致降煙堿含量增高與NNN 含量增加密切相關(guān)。

表3 不同雪茄品種TSNAs 含量及其比值比較Tab. 3 Comparison of TSNAs content and ratio of different cigar varieties

分 析4 種TSNAs 占 總TSNAs 的 比 例 可 知，雪茄煙葉中NNN 和NAT 平均值分別為49.26%和39.57%，所占比例較高，是主要的TSNAs， 但不同雪茄品種NNN 和NAT 占TSNAs 的比例差異顯著，其中NNN 百分比的變異范圍最大，為33.14 % ～85.63%，其受品種煙堿轉(zhuǎn)化率的強烈影響，在高煙堿轉(zhuǎn)化率品種中NNN 占比極高。NAT 百分比的變異范圍為32.20%～54.68%。NNK 占總TSNAs 的比例平均為9.39%，以NAB 所占比例最低。

比較茄衣和茄芯兩類品種可知，茄衣品種的TSNAs、NNN 含量顯著高于茄芯，NAT、NNK 和NAB 含量低于茄芯。茄衣和茄芯品種的TSNAs 含量平均值分別為3404.07 ng/g 和2775.12 ng/g。茄衣品種的NNN 含量平均值為2227.22 ng/g，是茄芯NNN含量的1.78 倍。茄衣品種NNN/TSNAs 的平均值為也高于茄芯品種。

2.3 TSNAs 與生物堿、硝酸鹽含量之間的相關(guān)性分析

對所測數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析，得到了不同雪茄品種TSNAs 與其前體物質(zhì)之間的相關(guān)關(guān)系（表4）。由分析結(jié)果可知，NNN 與降煙堿含量和煙堿轉(zhuǎn)化率之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.802 和0.794。TSNAs 與降煙堿和煙堿轉(zhuǎn)化率之間也存在極顯著相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.676 和0.672。NNN 含量與總TSNAs 含量相關(guān)系數(shù)高達0.942，表明NNN 含量對總TSNAs 含量貢獻很大，NNN 含量增高是造成總TSNAs 含量增高的主要原因。此外，NAT 含量與新煙草堿和總生物堿總量相關(guān)系數(shù)也比較大。NNK 含量與煙堿呈極顯著正相關(guān)，與降煙堿和煙堿轉(zhuǎn)化率呈極顯著負相關(guān)。煙堿與煙堿轉(zhuǎn)化率和降煙堿含量之間呈負相關(guān)關(guān)系。硝酸鹽與亞硝酸煙之間存在極顯著正相關(guān)關(guān)系。

表4 雪茄煙 TSNAs 含量與生物堿、硝酸鹽含量的相關(guān)系數(shù)Tab.4 Correlation coefficient between TSNAs content and alkaloid and nitrate content in cigars

圖1 NNN 與降煙堿含量的相關(guān)關(guān)系Fig.1 Correlation between NNN and nornicotine content

圖2 NNN 與煙堿轉(zhuǎn)化率的相關(guān)關(guān)系Fig.2 Correlation between NNN and nicotine conversion rate

3 討論

生物堿是雪茄煙葉中一類核心化學(xué)成分，生物堿的組成和含量不僅直接影響雪茄的生理強度、滿足感、香吃味等感官質(zhì)量，而且作為煙草特有亞硝胺等有害物質(zhì)的直接前體物對其形成和積累有重要影響[1,14-15]。本試驗通過對我國引進的代表性雪茄品種進行分析測定，觀察到雪茄煙葉普遍存在煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化問題，一些雪茄品種調(diào)制和發(fā)醇后煙葉的平均煙堿轉(zhuǎn)化率和降煙堿含量很高，表明煙株群體中存在大量煙堿轉(zhuǎn)化能力很強的轉(zhuǎn)化株。由于仲胺類的生物堿具有較大的不穩(wěn)定性，降煙堿極易與亞硝酸發(fā)生亞硝化反應(yīng)生成NNN，并導(dǎo)致總TSNAs水平增高[1,16]，本試驗相關(guān)分析表明，雪茄煙葉中NNN 和總TSNAs 含量與煙堿轉(zhuǎn)化率和降煙堿含量存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，因此，在同一栽培、調(diào)制和發(fā)醇條件下煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化導(dǎo)致降煙堿含量異常增高是雪茄煙葉NNN 含量和總TSNAs 含量升高的主要原因。根據(jù)前人研究結(jié)果[16]，煙堿轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的降煙堿多為S 構(gòu)型，由其產(chǎn)生的S 構(gòu)型NNN 具有更大的危害性，所以在轉(zhuǎn)化株中形成的TSNAs 有害性很大。煙堿轉(zhuǎn)化性狀是一種顯性遺傳，有效鑒別和去除轉(zhuǎn)化株可以使煙株群體得以優(yōu)化，選育低煙堿轉(zhuǎn)化率雪茄品種，或者對現(xiàn)有雪茄品種進行純化改良是降低雪茄煙葉TSNAs 含量的重要途徑[17]。

在雪茄煙中，四種TSNAs 中以NNN 和NAT 含量相對較高，其次為NNK，以NAB 含量最低，在非轉(zhuǎn)化株的煙葉中，NAT 含量一般高于NNN 含量，而在轉(zhuǎn)化株煙葉中，由于NNN 的大量形成，致使NNN 的含量遠遠高于NAT，因此，NNN/NAT 的值和占總TSNAs 的比例與煙堿轉(zhuǎn)化率密切相關(guān)[18]。本試驗所試茄衣品種和茄芯品種總生物堿含量有一定差異，茄芯品種平均生物堿含量水平相對較高，但茄衣品種的煙堿轉(zhuǎn)化率和降煙堿含量高于茄芯品種，進而使NNN 含量形成增多，導(dǎo)致煙葉NNN 含量和總TSNAs 含量的平均值較高。關(guān)于茄衣品種煙堿轉(zhuǎn)化率高的原因可能主要是不同品種基因型造成的，有待進一步研究。本研究表明NNN 含量與降煙堿關(guān)系顯著，但NNK、NAT、NAB 與相應(yīng)的前體物相關(guān)性較小，這可能是因為各TSNAs 合成之間存在競爭。根據(jù)蔡斌等人的研究結(jié)果[16]，NNK、NAB 和NAT的含量受NNN 影響，即降煙堿可以和其它三個生物堿競爭亞硝化反應(yīng)，所以當煙堿轉(zhuǎn)化率較高時，其它三個生物堿與其亞硝化產(chǎn)物的相關(guān)性降低。本試驗中，雪茄煙葉內(nèi)的硝酸鹽與和亞硝酸鹽與TSNAs含量之間的相關(guān)性較小，與之前研究報道有所不同[19-20]，本研究是在生態(tài)環(huán)境和栽培條件一致的條件下研究品種間的差異，由于煙堿轉(zhuǎn)化性狀是遺傳突變造成的，因此煙堿轉(zhuǎn)化導(dǎo)致的NNN 含量相應(yīng)增加也是遺傳因素引起的結(jié)果，煙葉硝態(tài)氮含量受施氮量、氮素形態(tài)等栽培因素的強烈影響，因此，在栽培條件相對一致的試驗條件下，硝態(tài)氮含量變化較小，其對TSNAs 形成的影響容易被遺傳因素形成的影響而掩蓋。

4 結(jié)論

雪茄煙品種不同程度上存在煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化問題，品種間降煙堿含量和煙堿轉(zhuǎn)化率存在顯著差異。雪茄煙葉樣品NNN 和TSNAs 含量與降煙堿含量和煙堿轉(zhuǎn)化率存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系，煙堿轉(zhuǎn)化導(dǎo)致降煙堿含量增高是雪茄煙葉NNN 和TSNAs 含量增高的直接原因，對雪茄品種進行煙堿轉(zhuǎn)化性狀改良是降低雪茄煙葉TSNAs 含量的有效途徑。