劉俊，張友旺，潘龍瑞，譚艷

（1.錦州醫(yī)科大學(xué) 湖北醫(yī)藥學(xué)院研究生培養(yǎng)基地，湖北 十堰442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 十堰 442000）

精子活動(dòng)力是決定男性生育能力的關(guān)鍵因素，由于精子活動(dòng)力下降導(dǎo)致的弱精子癥是男性不育的常見病因之一[1]。精子活動(dòng)力來源于細(xì)胞內(nèi)線粒體的氧化磷酸化和線粒體外的糖酵解途徑[2]。目前的研究表明，線粒體及其自噬在維持生精細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)及在成熟過程中發(fā)揮著重要作用[3-5]，但是線粒體及其自噬在維持人類精子活動(dòng)力方面的作用及調(diào)節(jié)自噬后對(duì)人類尤其是中國男性射精精子活動(dòng)力影響的研究較少見。故本研究通過觀察精子形態(tài)、檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 （microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3），以及線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶 （translocase of outer mitochondrial membrane 20，TOM20） 的表達(dá)水平，探索線粒體及其自噬對(duì)精子活動(dòng)力的影響，以期為男性不育癥的診斷、治療及預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2017年12月—2018年12月在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院男科及生殖中心就診的男性精液樣本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①精液濃度≥15×106個(gè)/ml；②年齡＞22歲；③排除有泌尿生殖系統(tǒng)疾病家族遺傳史及有手術(shù)外傷史等可能會(huì)影響精子質(zhì)量的患者。通過手淫取精于無菌取精杯內(nèi)，置37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)液化30 min。待精液完全液化后，按照WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第5版檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有的實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行精液常規(guī)檢查[6]，按照精子前向運(yùn)動(dòng)速率 （progressive motility，PR） 將其區(qū)分為4組：正常對(duì)照組 （PR ≥32%），輕度弱精子癥組 （20%≤PR＜32%），中度弱精子癥組 （10%≤PR＜20%），重度弱精子癥組 （0%＜PR＜10%）。每組30例，合計(jì)120例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，患者家屬簽署知情同意書。

1.2 試劑及儀器

Percoll 液購自美國Pharmacia公司，BWW精子培養(yǎng)液 （由Biggers-Whitten-Whittingham 研究小組在1971年發(fā)表，又稱為獲能培養(yǎng)液） 購自生工生物工程 （上海） 股份有限公司，電鏡固定液購自武漢谷歌生物科技公司，Mitotracker Deep Red （MTDR） 熒光染料購自北京中杉金橋生物科技有限公司，內(nèi)參GAPDH、兔抗LC3、TOM20一抗、HRP-山羊抗兔IgG 二抗及FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。制冰機(jī)、超凈工作臺(tái)、4℃冰箱、-20℃冰箱及37℃恒溫箱均購自青島海爾集團(tuán)，移液器及振蕩器購自北京Dragon-Lab 實(shí)驗(yàn)儀器公司，計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng) （computer-aided sperm analysis，CASA） 購自北京自然基因科技有限公司，高速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf公司，激光共聚焦免疫熒光成像系統(tǒng)購自荷蘭Olympus公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 精子的電鏡檢測(cè)取500 μl 精液標(biāo)本，加入約10倍體積的電鏡固定液室溫固定2 h，再轉(zhuǎn)移至4℃預(yù)冷1 h后，恒溫4℃冰袋運(yùn)輸至武漢谷歌生物科技有限公司，由該公司對(duì)標(biāo)本進(jìn)行處理后采集圖像，根據(jù)圖像分析各組精子中線粒體數(shù)量、形態(tài)、分布等。

1.3.2 Percoll 法分離精液為避免精液中的生精細(xì)胞及精漿中的白細(xì)胞對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，采用非連續(xù)梯度離心的方法對(duì)精子進(jìn)行分離。具體操作如下：將40%Percoll 液2 ml+80% Percoll 液2 ml+精液2 ml 緩慢分層加入離心管中，1 200 r/min 離心15 min，棄上清，底層沉淀即為分離出的精子。底層精子加入2 ml PBS，然后1 200 r/min 離心15 min，洗滌3次。鏡下確認(rèn)純化效果并計(jì)數(shù)，純化后的精子可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 Western blotting檢測(cè)LC3及TOM20的相對(duì)表達(dá)量將純化精子重懸于細(xì)胞溶解液RIPA，同時(shí)按1∶100的比例加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟 （100 mg/ml），超聲裂解10 s×5次，全程置于冰上操作。4℃、15 000 r/min 離心15 min，上清即為精子總蛋白。用上海碧云天生物技術(shù)有限公司的BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，加入5×SDS Loading buffer，100℃煮5 min。配置12% SDS-PAGE膠，每孔上樣30 μg蛋白，常規(guī)電泳和轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂牛奶的PBST 室溫封閉2 h，兔抗LC3、TOM20 一抗4℃孵育過夜。次日，PBST 洗膜8 min×3次。然后用HRP-羊抗兔IgG 二抗室溫孵育2 h，PBST 洗膜8 min×3次，用化學(xué)發(fā)光法 （ECL） 顯影。采用Image Lab 圖像分析軟件測(cè)定每條帶的灰度值，用樣本與相對(duì)應(yīng)內(nèi)參GAPDH的灰度值比值作為該樣本蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 免疫熒光檢測(cè)LC3及線粒體數(shù)量將純化的精子重懸于BWW精子培養(yǎng)液中，調(diào)整濃度為30×106個(gè)/ml，按照1∶100的比例加入兔抗LC3 一抗4℃孵育過夜，1 200 r/min 離心15 min，棄上清，PBS 1 200 r/min 離心15 min，洗滌3次，加入BWW精子培養(yǎng)液在顯微鏡下調(diào)整濃度為30×106個(gè)/ml，按照1∶100的比例加入FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG及MTDR熒光染料，避光孵育60 min，1 200 r/min 離心5 min，棄上清，PBS 1 200 r/min 離心5 min，洗滌3次，加入抗熒光淬滅封片劑重懸浮精子，取5 μl 混懸液置于載玻片上，使用蓋玻片推片，激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示；不服從正態(tài)分布的計(jì)量資料，經(jīng)轉(zhuǎn)化處理后服從正態(tài)分布，多組間比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同活動(dòng)力精子電鏡檢測(cè)結(jié)果

電鏡結(jié)果顯示，所有精液樣本中的精子頭部及鞭毛完整，未見畸形精子，但線粒體的形態(tài)、數(shù)量及分布存在差異。具體表現(xiàn)為：正常對(duì)照組可見線粒體位于精子尾部頸部至中段，線粒體與精子尾軸呈平行規(guī)則排列，以規(guī)則的圓形及卵圓形多見；線粒體數(shù)次50～70個(gè)不等，線粒體長徑與橫徑比約為2∶1，相鄰的線粒體分界清晰；線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)清晰，嵴膜和嵴間隙結(jié)構(gòu)較完整，內(nèi)有或無顆粒。輕度弱精子癥組可見精子線粒體數(shù)量較正常組減少，形態(tài)不規(guī)則，趨于圓形；雙層膜結(jié)構(gòu)尚存在，內(nèi)部可出現(xiàn)空泡化，線粒體旁可見自噬小泡形成。中度弱精子組可見精子線粒體數(shù)量較前進(jìn)一步減少，分布不均勻，主要集中在頭頸部，可出現(xiàn)雙重或3層重疊線粒體圍繞于軸絲，部分脫鞘，形態(tài)明顯不規(guī)則，線粒體嵴消失，腫脹明顯，伴有內(nèi)部明顯空泡化，可形成微囊狀結(jié)構(gòu)；腫脹的線粒體周圍可見大量自噬小泡形成。重度弱精子組可見線粒體排列紊亂、分布極不均勻，可沿尾部分散排列，伴有數(shù)量減少，體積縮小，膜間隙消失，局部可見形似凋亡小體的不規(guī)則高密度結(jié)晶狀物聚集。見圖1。

2.2 各組線粒體數(shù)量及LC3的表達(dá)

圖1 不同弱精子癥患者精子的線粒體結(jié)構(gòu) （電鏡×10 000）

激光共聚焦顯微鏡可見，在正常對(duì)照組中，線粒體主要位于精子頭部及尾部中段，被MTDR 染色后呈紅色，而FITC標(biāo)記的LC3熒光顆粒也同時(shí)位于此處，在熒光顯微鏡下呈綠色，紅綠兩者共定位，故呈黃色。隨著弱精子癥程度的加重，線粒體分布逐漸由頭部及尾部中段向整個(gè)尾部移動(dòng)，包括FITC標(biāo)記的LC3熒光顆粒也隨之向遠(yuǎn)處移動(dòng)，并伴有分布不均勻及數(shù)量減少。在不同組的精子中，線粒體的分布以及自噬發(fā)生的程度均有不同的表現(xiàn)，兩者存在共定位的現(xiàn)象。見圖2。

圖2 不同程度弱精子癥患者精子中線粒體及自噬顆粒分布情況 （激光共聚焦顯微鏡×63）

2.3 各組TOM20與LC3的表達(dá)

結(jié)果顯示，各組TOM20與LC3的表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。在不同程度弱精子癥組中LC3和TOM20表達(dá)隨著精子活動(dòng)力下降，呈現(xiàn)逐漸遞減趨勢(shì) （P＜0.05）。見表1和圖3、4。

表1 4組LC3及TOM20 蛋白表達(dá)水平比較 （n=30，±s）

表1 4組LC3及TOM20 蛋白表達(dá)水平比較 （n=30，±s）

注：①與正常對(duì)照組比較，P＜0.05；②與輕度弱精子癥組比較，P＜0.05；③與中度弱精子癥組比較，P＜0.05。

組別 LC3-Ⅱ/LC3-I TOM20正常對(duì)照組 3.51±0.52 1.33±0.31輕度弱精子癥組 6.52±0.31① 1.10±0.13①中度弱精子癥組 2.52±0.21①② 0.54±0.20①②重度弱精子癥組 0.98±0.12①②③ 0.21±0.07①②③F值 49.647 59.021 P值 0.000 0.000

圖3 各組TOM20 蛋白的表達(dá)

圖4 各組LC3 蛋白的表達(dá)

3 討論

良好的精子質(zhì)量是成功受精和后代存活的重要因素，通常可由多個(gè)質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估[7]。精子活動(dòng)力是男性生育能力的關(guān)鍵因素。對(duì)人類而言，發(fā)育成熟的精子只有獲得運(yùn)動(dòng)能力后才能穿透宮頸黏液，抵達(dá)輸卵管壺腹部與卵子結(jié)合形成受精卵[8-9]。而外界環(huán)境污染、不良生活習(xí)慣、免疫因素或理化因素等均可導(dǎo)致人類精子活動(dòng)力降低[10-12]。早在1955年已經(jīng)證實(shí)，精子活動(dòng)力的能量來源是三磷酸腺苷 （ATP）[13-14]。而精子內(nèi)ATP的來源也與大多數(shù)真核生物一樣來源于2條通路：細(xì)胞內(nèi)的氧化磷酸化和糖酵解，但是關(guān)于能量代謝通路的主導(dǎo)作用一直備受爭議[15]。

目前多數(shù)研究認(rèn)為，由于糖酵解相關(guān)酶系存在于細(xì)胞質(zhì)中，反應(yīng)速度快，涉及的環(huán)節(jié)少，相對(duì)于復(fù)雜的三羧酸循環(huán)更加適用于精子的能量供應(yīng)；同時(shí)由于精子尾部軸絲的“9+2”微管結(jié)構(gòu)相互滑動(dòng)過程導(dǎo)致精子活動(dòng)的過程中所需的ATP數(shù)量巨大，需要ATP的快速供應(yīng)，這時(shí)由于線粒體位于精子尾部中段，距離軸絲尾部較遠(yuǎn)，所產(chǎn)生的ATP無法快速轉(zhuǎn)運(yùn)至軸絲尾部，所以此時(shí)糖酵解反應(yīng)的快速性就成為軸絲尾部運(yùn)動(dòng)所需ATP的主要“供給者”。結(jié)合國內(nèi)外的研究，糖酵解可提供精子尾部運(yùn)動(dòng)所需能量的80%～90%，而線粒體僅提供約10%～20%[16-17]。線粒體作為成熟精子唯一保留的細(xì)胞器，在維持精子正常功能過程中尤其是精子的發(fā)育成熟過程中發(fā)揮重要的作用[18-19]。研究證實(shí)，精子線粒體與受精卵中父系線粒體DNA的清除有重要關(guān)聯(lián)[20]。線粒體在發(fā)揮活性功能的同時(shí)產(chǎn)生的諸如活性氧類 （reactive oxygen species，ROS） 等代謝物需要特定的通路進(jìn)行代謝。正常情況下，睪丸內(nèi)ROS的產(chǎn)生及清除處于一種相對(duì)平衡的狀態(tài)。生理濃度的ROS不僅對(duì)精子無害，而且還可以誘導(dǎo)其頂體反應(yīng)，促進(jìn)精子的獲能；但是當(dāng)ROS的濃度超過一定程度，男性生殖系統(tǒng)內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)難以將其清除時(shí)，ROS 可對(duì)精子的生存及活動(dòng)力產(chǎn)生危害，稱之為氧化應(yīng)激[21]。而線粒體在此過程中正是通過自噬發(fā)揮一定的清道夫功能。本研究中，通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)，隨著弱精子癥程度的加重，線粒體形態(tài)逐漸發(fā)生水腫空泡化，同時(shí)伴有自噬小泡數(shù)量逐漸增多，但是隨著弱精子癥程度的進(jìn)一步加重至重度弱精子癥時(shí)，自噬減弱甚至消失，主要因?yàn)榫€粒體的大量破壞，使其無法發(fā)揮正常功能。

精子活動(dòng)力與精子線粒體的損傷程度息息相關(guān)，隨著弱精子癥程度的加重，線粒體的形態(tài)、分布、功能等均發(fā)生改變，正常線粒體的數(shù)量逐漸減少，在此過程中線粒體自噬可能對(duì)精子活動(dòng)力起到一個(gè)正向調(diào)節(jié)作用，但是當(dāng)損傷線粒體達(dá)到一定程度和數(shù)量后，線粒體無法發(fā)揮正常功能，自噬減弱或消失從而導(dǎo)致精子活動(dòng)力呈現(xiàn)塌方式下降。本研究僅僅通過對(duì)弱精子癥分度后進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)線粒體膜蛋白及自噬標(biāo)記蛋白表達(dá)呈現(xiàn)出一定趨勢(shì)，尚未通過對(duì)線粒體功能及自噬過程的干擾觀察到精子活動(dòng)力改變，需要后期研究深入探討。

綜上所述，雖然目前尚未明確射精精子活動(dòng)力調(diào)節(jié)就是線粒體自噬在發(fā)揮作用，但是線粒體自噬在精子活動(dòng)力的調(diào)節(jié)中起到很大的作用，隨著精子活動(dòng)力的減弱，線粒體數(shù)量及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)均發(fā)生一定程度的改變，并且不同程度弱精子中線粒體的功能對(duì)于精子活動(dòng)力有一定的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)然本研究未考慮到精漿中的成分對(duì)精子活動(dòng)力的影響。因此，可以通過調(diào)節(jié)射精精子線粒體自噬的強(qiáng)度來調(diào)節(jié)精子的活動(dòng)力，從而為弱精子癥的治療提供一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。